遗传性铁粒幼细胞贫血致病的ALAS2基因表达载体的构建

摘要：

X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)是红系特异性δ-氨基γ-酮戊酸合酶(δ-amionlevulinic acid syntase 2,ALAS2)基因突变造成的,本研究构建ALAS2基因的真核表达载体,观察表达载体转染真核细胞后蛋白表达的情况.将获自人胎肝的ALAS2基因插入到红色荧光蛋白质粒pDs-red2-N1中,命名为pDs-red2-N1/ALAS2;采用电穿孔方法将质粒转染K562细胞;转染后48小时提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测ALAS2基因表达;流式细胞术检测红色荧光蛋白表达.再采用脂质体方法将质粒转染COS7细胞,转染后72小时提取细胞总RNA,RT-PCR检测ALAS2基因表达,荧光显微镜观察COS7细胞红色荧光蛋白表达情况.结果表明:构建了一种pDs-red2-N1/ALAS2真核表达载体,提取质粒DNA经酶切、电泳可以看到在4 700bp和1 764 bp处存在两条电泳条带;全长测序证实构建的载体序列正确;质粒转染K562和COS7细胞后均出现阳性ALAS2基因转录产物;流式细胞术检测转染后K562细胞红色荧光蛋白表达的阳性细胞百分率为19.2%;荧光显微镜显示转染后COS7细胞红色荧光蛋白,表达高峰出现在转染后第3天,阳性细胞百分率为10.7%,并可持续表达10天左右.红色荧光蛋白的表达可以间接说明ALAS2基因的表达.结论:ALAS2基因的真核表达载体构建成功,可以通过电穿孔和脂质体的方法转染真核细胞中并在其胞浆中表达,有可能用于XLSA患者基因替代治疗.

关键词：遗传性铁粒幼细胞贫血、ALAS2基因、载体构建、基因转染、基因治疗

所属期刊栏目：12

分类号：R556.9(血液及淋巴系疾病)

在线出版日期：2004-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：687-693