新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

摘要：

猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒,感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状,和猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)临床症状极其类似,且临床上混合感染病例较多,单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病,因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义.参照GenBank登录的PDCoV M基因和PEDV ORF3基因特异性序列设计引物,扩增相应的基因片段,克隆构建重组质粒pMD-18T-PDCoV-M与pMD18T-PEDV-ORF3,测序验证后,分别以此重组质粒为标准品,建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR方法,并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化,同时对所建立的双重荧光RT PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测.结果显示,该试验成功建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR方法,最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28.6拷贝/μL和99.6拷贝/μL的质粒浓度,显示出较好的敏感性;在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性;特异性试验表明,该方法仅能检测出PEDV和PDCoV,而对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病毒(PRV)等均不产生特异性扩增曲线.将所建立的双重荧光RT-PCR方法以及单重荧光定量RT-PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PD-CoV检测,结果显示,PDCoV阳性样品41份,阳性率为20.7％;PEDV阳性样品59份,阳性率为29.8％;同时感染这2种病毒的样品17份,阳性率为8.6％.与单重荧光定量RT-PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样,符合率100.0％.本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT-PCR方法,能同时准确地检测PDCoV和PEDV,这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础.

关键词：猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、双重荧光RT-PCR、SYBR Green Ⅰ

所属期刊栏目：38

分类号：S855.3;S852.65(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家重点研发计划基金资助项目2016YFD0500102;河南省科技开放合作基金资助项目152106000047

在线出版日期：2018-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：618-624