禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2蛋白表达、纯化及其间接ELISA方法建立

摘要：

PCR扩增irp2主要抗原表位区,构建pET-32α-irp2表达载体,转化BL21(DM3)细胞诱导表达.以纯化irp2蛋白为抗原建立ELISA检测方法,确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液与封闭条件和临界值等参数,进行ELISA性能检测及应用.结果显示,PCR扩增出约519 bp特异性irp2主要抗原表位基因,经菌液PCR、双酶切及DNA测序显示成功构建pET-32α-irp2表达载体.irp2目的蛋白获得有效表达,相对分子质量大小约34 500,亲和纯化后纯度达90％以上.Western blot显示目的蛋白irp2与抗血清在约34 500出现特异性显示条带.确定ELISA抗原包被质量浓度3.25 mg/L、血清稀释度1∶80,封闭液为5％脱脂奶粉,封闭条件37℃1 h+4℃10h,临界值为0.320.性能检测显示,其敏感性可达1∶5 120;与鸡白痢沙门菌、鸡传染性鼻炎、鸡霉形体、鸡巴氏杆菌、HPI大肠杆菌等血清无交叉反应特异性,批内、批间变异系数分别为3.40％～6.71％和5.20％～8.44％;与PCR方法对124份血清平行试验其符合率93.8％;对1 425份临床血清样品irp2抗体阳性检出率37.4％.结果表明,建立了可检测血清中irp2蛋白抗体的间接ELISA方法,适用于临床血清样品进行快速抗体检测,为HPI大肠杆菌的流行病学调查和致病性大肠杆菌免疫机制研究奠定基础.

关键词：大肠杆菌、毒力岛、irp2、ELISA

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分类号：S855.12(动物医学（兽医学）)

资助基金：山东省自然科学基金资助项目ZR2014CQ012,ZR2017MC056;国家自然科学基金资助项目31402243;山东省家禽产业创新团队滨州综合试验站资助项目SDAIT-11-16

在线出版日期：2018-05-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：287-292,300