环介导等温扩增联合横向侧流试纸(LAMP-LFD)对嗜水气单胞菌快速检测方法的建立

摘要：

以嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因为检测靶标,设计6条特异性引物和1条异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记探针,建立了嗜水气单胞菌的LAMP-LFD快速检测方法.该方法的流程可简单概括为将生物素标记的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)产物与FITC标记的探针进行特异性杂交,并使用横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)完成检测.经优化,LAMP最佳反应条件为63℃,反应30 min,从LAMP扩增到LFD结果判读仅需40 min,比常规PCR检测缩短近2h.试验结果表明,LAMP-LFD可特异性检出嗜水气单胞菌,对鳗弧菌等常见水产或食源性病原菌检测结果为阴性;其针对细菌纯培养物的检测灵敏度达2.03×101 CFU/mL或0.81 CFU/反应,是常规PCR(以F3/B3为引物)的100倍;可从人工污染1×102 CFU/mL浓度的嗜水气单胞菌的鲫鱼肝组织匀浆样品中检测到细菌.嗜水气单胞菌(106 CFU)人工感染鲫鱼24 h,传统的细菌分离培养方法可获得肝、肾的载菌量分别为1.2×105 CFU/g和6×103 CFU/g;利用LAMP-LFD技术可成功从鲫鱼的肝、肾组织中检测出该病原;以F3/B3为引物的PCR方法仅能从感染鲫鱼的肝组织中检测到该病原菌,表明面对实际感染样品,LAMP-LFD的检测灵敏度优于PCR方法.因此,该方法可快速、灵敏、特异地检测出嗜水气单胞菌,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有望成为嗜水气单胞菌现场检测的常规技术手段.

关键词：嗜水气单胞菌、环介导等温扩增、横向侧流试纸、促旋酶B亚单位基因、检测

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分类号：S852.61(动物医学（兽医学）)

资助基金：国家高技术研究发展计划资助项目863计划2012AA092001;浙江省重大科技专项重点社会发展资助项目2013C03045-1;宁波大学学科资助项目XKL14D2083.xkzscl417;宁波大学2015年度研究生科研创新基金资助项目

在线出版日期：2016-06-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：256-264