利用CRISPR/Cas9技术敲除CHO-K1细胞中GS基因的研究

摘要：

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)是合成CHO细胞生长所需要的谷氨酰胺的关键酶.为了获得能快速稳定表达外源蛋白的CHO细胞GS筛选系统,根据CRISPR/Cas9技术原理,针对GS基因设计3对sgRNA,分别将连接sgRNA的pX459质粒转染至CHO-K1细胞中以便定向敲除GS基因;经筛选后利用PCR及测序分析鉴定GS基因敲除情况;将GS基因敲除的CHO细胞株(CHOGS-/-)分别在含有外源谷氨酰胺培养基与无谷氨酰胺培养基中进行培养,观察细胞的生长状态,绘制生长曲线,并验证该CHOGS-/-细胞株中外源基因的表达能力.结果显示,sgRNA3与sgRNA4共转染能高效双靶位敲除CHO细胞中的GS基因;生长曲线显示CHOGS-/-细胞在富含谷氨酰胺的培养基中生长速度正常或无差异,但无法在无谷氨酰胺的培养基中存活,这表明GS基因功能被破坏;外源基因表达水平及功能验证显示,敲除GS基因后不影响外源单抗在细胞中的表达.这表明,借助CRISPR/Cas9敲除系统获得了CHOGS-/-细胞,大大提高了稳定转染外源基因阳性细胞株的筛选效率,为后期利用CHO细胞大量发酵表达蛋白技术建立了坚实的分子生物学平台.

关键词：CRISPR/Cas9、CHO-K1细胞系、谷氨酰胺合成酶基因、基因敲除

所属期刊栏目：52

分类号：S852(动物医学（兽医学）)

资助基金：中国检验检疫科学研究院基本科研业务费项目2020JK020

在线出版日期：2022-12-05（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1273-1280