10.16656/j.issn.1673-4696.2018.0023
基于N蛋白的PEDV间接ELISA检测方法的建立与初步应用
本研究旨在原核表达猪流行性腹泻病毒(porcine epizootic diarrhea virus,PEDV)的核衣壳(N)蛋白,以重组N蛋白作为包被抗原建立PEDV血清抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用.克隆PEDV N基因并将其插入到原核表达载体pET-28a中,转化BL21感受态细胞进行诱导表达,对表达的N蛋白进行镍柱纯化及Western-blot鉴定;将纯化的N蛋白作为包被抗原并优化反应条件,建立检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测.原核表达得到大小为58ku的重组N蛋白,Western-blot检测表明N蛋白具有良好的特异性和反应原性.PEDV间接ELISA方法的最优反应条件为抗原包被量每孔0.05 μg,血清以1∶200倍稀释,作用1.0h,酶标二抗以1∶5 000倍稀释,作用lh,TMB显色时间为25 min.在该优化条件下,D450＞0.269为阳性,反之为阴性.特异性试验表明,对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV阳性血清检测结果均为阴性,特异性良好;对96份阳性血清进行检测,敏感性为98.9％.重复性试验表明,批内变异系数0.99％～2.33％,批间变异系数3.54％～6.67％.用本试验建立的体系对临床上164份血清进行检测,阳性率为56.7％,与标准试剂盒的符合率为95.1％.总之,本试验建立的基于原核表达的N蛋白作为检测抗原的PEDV血清间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、重复性好,可用于临床PEDV血清抗体的检测.
猪流行性腹泻病毒、N蛋白基因、原核表达、间接ELISA
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S852.65(动物医学（兽医学）)
陕西省农业科技创新与科技攻关计划;农业科技创新项目;农业科技示范推广项目
2018-03-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共7页
148-154
