10.13422/j.cnki.syfjx.20230793
基于JNK信号通路调控细胞自噬探讨化浊解毒活血通络方对脑缺血再灌注损伤的保护作用
目的:研究化浊解毒活血通络方通过c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路调控神经细胞自噬减轻脑缺再灌注损伤的作用机制.方法:60只SD大鼠随机分为假手术组、大脑中动脉阻塞/再灌注(MCAO/R)组(模型组)、化浊解毒活血通络方(中药)组(25.0 g·kg-1)、JNK抑制剂 SP600125(SP)组(5 mg·kg-1)、中药+SP组和 JNK激动剂 Anisomycin(Ani)组(15mg·kg-1)6组.造模24 h后中药组和中药+SP组给予中药汤剂灌胃,连续给药3d,其余各组灌胃等容积蒸馏水.神经功能评分评估神经功能缺损程度,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色确定脑梗死体积;苏木素-伊红(HE)染色观察脑组织结构变化;尼氏染色检测神经元损伤;原位末端标记法(TUNEL)观察细胞凋亡;透射电镜观察自噬小体超微结构;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脑组织中微管相关蛋白1轻链3A/B(LC3A/B)、自噬相关基因5(Atg5)、自噬关键分子酵母Atg6同系物1(Beclinl)、p62、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、JNK、磷酸化(p)-JNK和c-Jun的蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测各组大鼠脑组织中LC3A/B、Beclin1、p62、Atg5、Bcl-2、JNK、c-JunmRNA表达量.结果:与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P＜0.05),脑组织梗死体积明显变大(P＜0.05),海马区及其周围脑组织形成典型梗死表现,皮层有大量神经元细胞变性、坏死、液化、固缩和深染,有炎性细胞浸润,电镜下可见炎症细胞浸润,线粒体、溶酶体、自噬体和自噬溶酶体严重肿胀.细胞凋亡情况较重,TUNEL阳性细胞明显增加(P＜0.05),脑组织内神经元核膜和核仁模糊,突起不连续,胞质尼氏体色浅且数量减少.Western blot结果显示大鼠脑组织LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达明显升高(P＜0.05),p62 和 Bcl-2 蛋白表达明显降低(P＜0.05),Real-time PCR 结果显示 LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、c-Jun mRNA 表达明显增加(P＜0.05),p62、Bcl-2mRNA表达明显降低(P＜0.05).与模型组比较,中药组、SP组与中药+SP组大鼠神经功能缺损评分均明显降低(P＜0.05),梗死体积明显缩小(P＜0.05),脑组织病理状态均有所改善,尤以中药组改善明显;线粒体M嵴丰富,基本正常,内质网轻度扩张,高尔基体轻度肿胀,细胞核核膜轻度融合,溶酶体、自噬小体、自噬溶酶体可见,但数量较少,TUNEL阳性细胞明显减少(P＜0.05),凋亡情况有所减轻,尤以中药组最为显著,脑组织神经元核仁、核膜可辨,胞浆尼氏体有一定程度的脱失,但较模型组明显减轻.Westernblot结果显示中药组、SP组与中药+SP组LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达明显降低(P＜0.05),中药组和SP组p62蛋白表达明显升高(P＜0.05),中药组和中药+SP组Bcl-2蛋白表达明显升高(P＜0.05).Real-time PCR显示中药组、SP组和中药+SP组大鼠脑组织LC3A、LC3B、Beclin1、Atg5、JNK、c-JunmRNA表达明显降低(P＜0.05),p62 mRNA表达明显增加(P＜0.05);中药组和中药+SP组Bcl-2 mRNA表达明显增加(P＜0.05).Ani组评分明显升高(P＜0.05),梗死体积显著增加,神经元细胞坏死情况加重,炎性浸润明显,神经元核膜融合、异型凸起,异染色质增加,边缘聚集,线粒体肿胀严重,内质网扩张,溶酶体增加,胞浆内囊泡增多,可见自噬体和自溶酶体,TUNEL阳性细胞增加(P＜0.05),凋亡情况较重,尼氏小体数量明显减少,脱失较重,着色浅,核仁核膜模糊;Ani组Atg5、c-Jun、JNKmRNA表达增加(P＜0.05),Beclin1、p62、Bcl-2 mRNA 表达明显降低(P＜0.05).与中药组和 SP 组比较,Ani 组 LC3 A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun蛋白表达明显升高(P＜0.05),p62、Bcl-2蛋白表达明显降低(P＜0.05).与中药组比较,SP组和中药+SP组大鼠脑组织 JNKmRNA 表达降低(P＜0.05);Ani 组 LC3A、LC3B、Atg5、c-Jun、JNK mRNA 表达增加(P＜0.05),Bcl-2 表达明显降低(P＜0.05).与 SP 组比较,Ani 组 Atg5、c-Jun、JNK mRNA 表达明显升高(P＜0.05),Beclin1、p62、Bcl-2 mRNA 表达明显降低(P＜0.05).结论:化浊解毒活血通络方可上调LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun蛋白的表达,下调p62、Bc1-2蛋白表达;提高LC3A/B、Beclin1、Atg5、JNK、p-JNK、c-Jun mRNA表达,降低p62、Bcl-2 mRNA表达,表明化浊解毒活血通络方可通过JNK信号通路抑制自噬减少大鼠缺血/再灌注损伤.
化浊解毒活血通络方、脑缺血再灌注损伤、自噬、c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路、大脑中动脉阻塞/再灌注(MCAO/R)模型
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R22;R242;R2-031;R285.5;R255.2;R743.3(中医基础理论)
河北省重点研发项目;河北省中医药管理局科研计划项目;河北中医学院科研能力提升重点项目
2023-04-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共11页
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