CRISPR/Cas9介导人HBB基因突变体在猪成纤维细胞的靶向敲入

摘要：

目的 将人地贫相关基因HBB(hHBB)的高频突变体基因型Condons41/42(-CTTT)靶向敲入猪成纤维细胞,并筛选出基因型阳性的纯合子细胞系.方法 (1)合成人地贫相关基因HBB(hHBB)突变体,并构建猪HBB位点两条同源臂载体.(2)利用infusion技术将hHBB突变体插入两个同源臂之间,构建同源重组终载体.(3)用在线软件http://crispr.mit.edu/设计靶向猪HBB的sgRNA,并在猪PK15细胞中验证其活性.(4)利用电转染法把CRISPR/Cas9、sgRNA和目的载体共同转入巴马猪胎儿成纤维细胞中,筛选单细胞克隆.结果 (1)合成了hHBB突变体,从野生型巴马猪基因组上扩增左同源臂(1.062×103)以及右同源臂(1.024×103),并将三者连接到终载体pGH-LA-hHBB-RA.(2)设计合成了11条靶向猪HBB基因的sgRNA,全部验证活性后最终挑选#2sgRNA和#11sgRNA用于后续实验.(3)通过CRISPR系统共制备出15株有hHBB突变体定点敲入的猪成纤维细胞系,其中6株细胞正常表达hHBB基因.结论 本研究所制备的携带人源化HBB基因突变体的猪成纤维细胞,将为创制高度模拟人地贫的模型猪奠定基础.

关键词：地中海贫血、HBB基因突变体、同源重组、靶向敲入、成纤维细胞

所属期刊栏目：28

分类号：Q95-33(动物学)

资助基金：广东省深圳市大鹏新区产业发展专项资金;深圳市基因组辅助育种工程实验室提升项目;深圳市卫计委医疗卫生"三名工程";广东省基础与应用基础研究基金

在线出版日期：2021-01-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共9页

页码：779-787