结合内标的小鼠诺如病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

摘要：

目的 建立一种快速、特异、敏感的荧光定量RT-PCR检测方法,用于小鼠诺如病毒(murine norovir-uS,MNV)的检测.方法 根据MNV ORF1-ORF2结合区域中保守序列设计一对特异性引物和Taqman探针,同时设计和制备了内标用于监控假阴性,建立含有内标的荧光定量RT-PCR检测体系,通过优化,得到最佳反应体系和反应条件;构建质粒标准品并以之为模板绘制标准曲线;进行特异性、敏感性和重复性试验,最后用建立的方法检测344份小鼠临床样本,验证在临床应用中的效果.结果 该方法特异性强,与小鼠肝炎病毒、小鼠脑脊髓炎病毒、仙台病毒、小鼠肺炎病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、出血热病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒不发生交叉反应.构建的荧光定量标准曲线Ct值与模板浓度呈良好的线性关系相关系数r2=0.9986,可以检测到10 copies /μL的质粒标准品,对MNV活病毒检测可检测到1.78×10-2 TCID50/mL的病毒,检测灵敏度比常规RT-PCR高10倍,比病毒分离高100倍.对5份样品进行5次批内和批间重复检测,检测结果变异系数均小于2％.通过对344份临床样品检测,检测到阳性样品103份,阳性率29.94％.有5份样本结果为假阴性.结论 建立的MNV荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,由于加入了内标,能有效地监控假阴性的出现,适合用于MNV日常监测、临床诊断和流行病学调查.

关键词：小鼠诺如病毒、荧光定量RT-PCR、内标

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分类号：Q95-33(动物学)

资助基金：国家科技支撑计划2013BAK11B01;广东省科技计划项目2011B040200010;广东省科技计划项目2012B010300026

在线出版日期：2015-04-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：49-56