版纳微型猪近交系TNF-α基因mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要：

目的 快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要基因TNF-α的表达情况,构建TNF-α基因及内参GAPDH基因荧光定量PCR质粒标准品.方法 利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪建立动物模型,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物.进行RT-PCR扩增.纯化目的片段与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR,生成标准曲线.结果 建立的TNF-α基因和GAPDH内参基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法灵敏度分别可达10<'3>和10<'5>拷贝,线性范围分别为10<'3>～10<'9>和10<'5>～10<'9>拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在的线性关系R<'2>分别为0.993和0.999,扩增效率E分别为111.073%和95.948%.结论 成功的构建了版纳微型猪近交系TNF-α基因质粒标准品和标准曲线,并用内参基因GAPDH进行校正,此方法可为探讨TNF-α基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础.

关键词：版纳微型猪近交系、实时荧光定量、TNF-α基因、GAPDH基因、基因表达

所属期刊栏目：19

分类号：Q95-33(动物学)

资助基金：云南省应用基础研究计划面上项目2010ZC241;云南省教育厅科学研究基金2010Y219

在线出版日期：2011-07-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：153-160