分型鉴别HPIV1、HPIV2及HPIV3多重荧光定量RT-PCR方法的建立及验证
目的 建立可同时鉴别人副流感病毒1型(human parainfluenza virus type 1,HPIV1)、2型(HPIV2)、3型(HPIV3)的多重荧光定量RT-PCR方法,并进行验证.方法 通过数据库下载HPIV1、HPIV2和HPIV3全基因组序列进行比对分析,选择保守区域,针对这3种病毒分别设计特异性引物及探针,以人核糖核酸酶P(RNase P)为内质控,建立多重荧光定量RT-PCR检测方法,并对方法的灵敏度、特异性和精密度进行验证.采用建立的方法对192份临床样本进行检测.结果 经优化后,确定多重荧光定量RT-PCR反应体系为30μL,其中10 × NeoscriptRTase/UNG Multi mix 3 μL,5 × Neoscript RT Premix Multi Buffer 6 μL,HPIV1、HPIV2、HPIV3(100 μmol/L)上下游引物各 0.1 μL,HPIV1、HPIV2、HPIV3探针(100 μmol/L)各 0.05 μL,RNase P上下游引物(50 μmol/L)各 0.06 μL,RNase P探针(50 μmol/L)各 0.03 μL,模板 15μL,ddH2O补至 30 μL.反应条件:50 ℃ 20 min,95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,54 ℃ 30 s,共45个循环,每个循环退火时收集荧光信号.建立的多重荧光定量RT-PCR方法对HPIV1、HPIV2和HPIV3的最低检测限均达到500 copies/mL;与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒无交叉反应;3种不同浓度的重组质粒标准品混合物组内和组间变异系数(CV)均小于3％.192份临床样本中,HPIV1、HPIV2和HPIV3均检测出,阳性率分别为7.81％、0.05％和3.1％.结论 本研究建立的HPIV1、HPIV2和HPIV3多重荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏度、特异性和精密度,在HPIV的快速诊断和鉴别领域具有较高的临床应用前景.
人副流感病毒、多重荧光定量RT-PCR、分型、鉴别
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R446.1(诊断学)
国家重点研发计划2019YFC1200603
2023-10-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共6页
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