11种常见支原体环介导等温扩增检测方法的建立及验证

摘要：

目的 建立一种用于同时检测多种支原体污染的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法,并进行验证.方法 通过SnapGene软件的多序列比对工具比对13种支原体16S rRNA基因的保守序列,根据保守序列设计2条内引物FIP和BIP、2条外引物F3和B3、环引物LOOP(LF/LB);建立LAMP体系:Bst DNA聚合酶大片段(8 U/μL)、10 × ThermoPoly反应缓冲液[20 mmol/LTris-HCl,10 mmol/L KCl,10 mmol/L(H4)2S04,2 mmol/L MgSO4,0.1％Triton X-100,pH 8.8]、MgSO4(100 mmol/L)、dNTP Mix、FIP/BIP Primers、F3/B3 Primers、LOOP Primers、无核酸酶水、模板DNA(13种搭载支原体16S rRNA的质粒).产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定.验证方法可行性、特异性、可重复性,确定方法检测限.结果 筛选的2组LAMP引物,组合使用可同时检测出11种支原体序列;在其他非特异模板检测中未出现非特异扩增,引物组特异性良好;建立的方法灵敏度好,最低检测限为30.1 copies/μL,且重复性好,未见假阳性和假阴性扩增.结论 LAMP技术可用于检测细胞培养中多种支原体污染的情况,特异性好、耗时短,可作为细胞培养中快速检测支原体污染的技术平台之一.

关键词：环介导等温扩增、支原体、16S rRNA

所属期刊栏目：36

分类号：Q93-3(微生物学)

资助基金：贵州省科技支撑计划;贵州省基础研究计划项目

在线出版日期：2023-08-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：980-986