艰难拟梭菌甲基化酶CamA蛋白的原核表达、纯化及其活性

摘要：

目的 原核表达具有甲基化酶活性的艰难拟梭菌CamA(Clostridiodies difficile adenine methltransferase A,CamA)蛋白.方法 PCR扩增艰难拟梭菌1870标准菌株CamA蛋白的基因序列,克隆至质粒pGEX-4T-l-MBP中,转化至大肠埃希菌HB101,经1 mmol/L IPTG诱导表达重组目的蛋白,利用Amylose Resin纯化后,CamA蛋白再经烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus,TEV)蛋白酶酶切,采用体外MTase-GloTM Methyltransferase Assay分析技术验证其甲基化活性.结果 PCR测序结果显示克隆的CamA基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pGEX-4T-1-MBP-CamA经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后显示1 731 bp的CamA基因已连接至载体上;表达的重组蛋白相对分子质量约为108 800(含1个MBP标签),经Amylose Resin纯化后,纯度达90％以上;在20 μmol/L DNA和20 μmol/L S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的条件下室温反应30 min,0.5 μg CamA能产生浓度约为101.60 nmol/L的S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl-L-homocysteine,SAH),酶活性为(0.339±0.027)U/mg.结论 成功表达并纯化了艰难拟梭菌CamA蛋白,其具有甲基化酶活性,为后续进一步研究CamA的功能及其在艰难拟梭菌感染发生、发展及治疗中的作用奠定了基础.

关键词：艰难拟梭菌、CamA蛋白、DNA甲基化酶、原核表达、纯化、酶活性

所属期刊栏目：36

分类号：R394.3

资助基金：浙江省自然科学基金重点项目;省部共建重大项目;浙江省自然科学基金探索项目;杭州医学院基本科研业务费基础科研项目

在线出版日期：2023-08-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：918-923