登革病毒Ban18HK20株非结构蛋白氨基酸定点突变对病毒增殖及毒力的影响
目的 探讨非结构蛋白氨基酸突变(NS1-G53D、NS3-E250V)对登革病毒(Dengue virus,DENV)4型Ban 18HK20株增殖及毒力的影响.方法 通过与DENV减毒株(PDK53)进行序列比对,确定Ban18HK20株突变位点;采用同源重组技术构建点突变质粒pSPTM-Ban18HK20(G53D)、pSPTM-Ban18HK20(E250V)、pSPTM-Ban18HK20(G53D+E250V),酶切及基因测序鉴定点突变质粒;体外转录获得病毒RNA,电转染Vero细胞拯救获得点突变病毒;通过蚀斑试验、间接免疫荧光试验、病毒全基因组测序、生长动力学试验、CCK-8试验和小鼠神经毒力试验对点突变病毒进行生物学特性鉴定.结果 酶切及测序证实点突变质粒构建正确.免疫荧光试验及病毒测序结果显示病毒拯救成功.点突变病毒比母本病毒蚀斑小.Ban18HK20(G53D)、Ban18HK20(E250V)、Ban18HK20(G53D+E250V)的病毒滴度第4天达峰值,分别为7.67、7.84、7.78 LgPFU/mL;母本病毒第5天达峰值,为7.68 LgPFU/mLo Ban18HK20(G53D)感染的BHK21细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高(P=0.003 6);Ban18HK20(G53D)、Ban18HK20(G53D+E250V)感染的C6/36细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高(P＜0.000 1).点突变病毒与母本病毒对 4 周龄 BALB/c 小鼠均无神经毒力;点突变病毒 Ban 18HK20(E250V)(LD50=8.51 PFU)、Ban 18HK20(G53D+E250V)(LD5o=0.69 PFU)对3日龄BALB/c乳鼠的神经毒力低于母本病毒(LD50=0.69 PFU);等量病毒经脑内注射后,点突变病毒Ban18HK20(G53D+E250V)对裸鼠的存活率(60％)高于母本病毒(0).点突变病毒遗传稳定,在Vero细胞上传至第10代未出现回复突变.结论 非结构蛋白NS1-G53D氨基酸突变减弱了 Ban18HK20株对C6/36和BHK21细胞的毒性,双点联合突变可减弱Ban18HK20株在裸鼠体内的神经毒力.本研究为DENV毒力位点研究及疫苗研发奠定了基础.
登革病毒、定点突变、病毒毒力、非结构蛋白
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R373.3+3(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)
国家科技重大专项2018ZX09101001-002
2023-08-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共9页
902-910
