黏质沙雷菌非特异性核酸内切酶通用型定量检测方法的建立及验证
目的 建立黏质沙雷菌(Serratiat marcescens)Benzonase?核酸 内 切酶(Serratia marcescens Benzonase? endonuclease,SMBE)通用型定量检测方法,并进行验证.方法 以突变体SMBE(第110位组氨酸突变为丙氨酸)基因BEHA为模板,PCR法扩增BEHA基因,插入至载体pET-20b(+)中,构建重组表达质粒pET-20b(+)-BEHA,经菌落PCR和测序鉴定.重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达后进行一步Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化,纯化产物经15％SDS-PAGE和分光光度计分析,并检测酶活性.用纯化BEHA免疫家兔,以获得的多克隆抗体作为包被抗体,标记HRP的多克隆抗体作为检测抗体,建立SMBE的双抗体夹心ELISA检测法.验证方法的线性范围、准确度、精密性,并确定定量限.采用建立的方法及市售试剂盒分别检测3个厂家生产的SMBE.结果 菌落PCR和测序鉴定证明,重组表达质粒pET-20b(+)-BEHA构建正确,第110位氨基酸成功突变为丙氨酸.BEHA的纯度＞95％,表达量为3mg/100mL,酶活性大幅降低.SMBE标准品在0～20 ng/mL范围内与A450呈良好的线性关系;16、10、0.6ng/mL的SMBE标准品重复检测3次的偏差分别为-3.06％、-5.40％、3.33％;12和2 ng/mL的SMBE标准品重复10次检测结果CV分别为2.48％和2.91％;定量限为0.2 ng/mL.与市售试剂盒比较,本研究建立的方法对3个厂家生产的SMBE检测结果更接近理论值.结论 建立的双抗体夹心ELISA法具有较好的准确度和精密性,该方法可定量检测多种市售SMBE产品,是一种SMBE的通用型定量检测方法.
黏质沙雷菌、非特异性核酸内切酶、Benzonase®核酸内切酶、双抗体夹心ELISA法
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Q819(生物工程学(生物技术))
山西省重点研发计划项目201903D321087
2023-02-15（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共6页
1495-1499,1505
