绿色荧光蛋白标记的BHK-21细胞源性外泌体的构建及鉴定

摘要：

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和外泌体标志蛋白CD63的BHK-21细胞,获得GFP标记的BHK-21源性的外泌体.方法 将慢病毒表达质粒pCT-CD63-GFP与辅助质粒pVS-VG(Env)和pSPAX(structure)共转染293T细胞,包装重组慢病毒,测定病毒滴度后感染BHK-21细胞,72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达GFP的细胞.Western blot检测BHK-21细胞中CD63的表达量.取其无外泌体血清培养36 h的稳定转染株细胞上清,获得提取物,经Western blot、透射电镜及粒径分析进行鉴定.将提纯的外泌体与受体细胞BHK-21共培养6 h后,观察外泌体在细胞中的摄取情况.通过Transwell试验检测登革病毒(Dengue virus,DENV)感染后细胞外泌体分泌量的变化.结果 筛选出可稳定表达GFP的BHK-21细胞株,并从细胞上清中提取了外泌体.外泌体存在特异性标志蛋白CD63和CD81;透射电镜下,外泌体呈椭圆形,具有双凹圆盘状膜结构,直径在30～200 nm之间;纳米颗粒示踪分析显示,外泌体在110.2 nm处有峰值;荧光显微镜下可见提纯的外泌体发出强烈的绿色荧光信号.提纯的外泌体与受体细胞BHK-21共培养6 h后,可在BHK-21细胞质内见到大量绿色荧光颗粒.Transwell试验发现,DENV感染后,可促进细胞释放外泌体.结论 成功构建了携带GFP标记的BHK-21源性外泌体,为研究外泌体在病毒感染细胞中的信号传递提供了工具.

关键词：外泌体、乳仓鼠肾细胞、绿色荧光蛋白、登革病毒

所属期刊栏目：35

分类号：R34(人体生物化学、分子生物学)

资助基金：国家自然科学基金;云南省重大专项;重点研发计划;中国医学科学院创新工程项目;云南省医学领军人才项目

在线出版日期：2023-01-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：1331-1337