截短型神经连接蛋白-1原核表达载体的构建、表达、纯化及其对阿尔茨海默症的初步治疗效果
目的 克隆并构建5种截短型神经连接蛋白-1(tneuroligin-1,tNL-1)可溶性细胞外片段的原核表达载体,经表达、纯化后获得重组GST-tNL-1融合蛋白,初步探讨其对阿尔茨海默症(Alzheimer disease,AD)的治疗效果.方法 对神经连接蛋白-1(neuroligin-l,NL-1)的结构特征及理化性质进行生物信息学分析.利用NL-1细胞外片段设计5个截短片段(tNL-l①～⑤),以NL-1细胞外片段1-691质粒为模板PCR扩增目的片段,构建pGEX-6Pl-tNL-1原核表达载体,筛选最佳诱导条件后,表达重组tNL-1蛋白,经GST亲和层析法纯化重组蛋白.制备β淀粉样蛋白(β-amyloid pro-tein,Aβ)寡聚体,并进行Western blot鉴定.将体外培养的人SHSY-5Y细胞随机分为3组:对照组(不加任何干预)、模型组(40 μg/mL Aβ 处理24h)、实验组(Aβ 与 20、40、60 μg/mL tNL-1②共处理 24 h),MTT法检测 tNL-1 ②对 Aβ诱导的SHSY-5Y细胞的保护作用.结果 NL-1有12个蛋白修饰位点,预测其中有8个修饰位点两两相关联,据此关联设计了 5个截短体.质粒pGEX-6P1-tNL-1经双酶切及测序鉴定证明构建正确.最佳诱导条件为:37℃培养2 h,A600为0.8时降温至16℃,加入0.1 mmol/LIPTG诱导12h.表达及纯化的重组tNL-1①～⑤蛋白相对分子质量分别约为68 000、90 000、66 000、53 000和62 000,大小均与预期相符,且可被抗体特异性识别.制备的Aβ寡聚体在相对分子质量约4 000和12 000处条带明显,主要以单体和三倍体形式存在.MTT结果显示,与对照组相比,模型组细胞生存率明显下降(P=0.001);与模型组相比,实验组细胞生存率均明显升高(P＜0.001).结论 Aβ对SHSY-5Y细胞存在毒性作用,制备的tNL-1能缓解Aβ对SHSY-5Y细胞模型的的增殖抑制作用.后续会将tNL-1蛋白应用于更多体内外试验中.为AD的治疗提供新思路.
截短型神经连接蛋白-1、阿尔兹海默症、原核表达、纯化、突触
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Q81(生物工程学(生物技术))
黑龙江省自然科学基金项目;牡丹江医学院研究生创新科研项目;牡丹江医学院附属红旗医院红旗科研基金科研项目;黑龙江省中医药科研项目
2023-01-11（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共9页
1317-1325
