重组Flag-pA-Tn5蛋白的原核表达及酶活性鉴定

摘要：

目的 构建Flag-葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A,SPA)与转座酶Tn5基因的重组原核表达质粒pTXBl-Flag-pA-Tn5,在大肠埃希菌中表达、纯化重组Flag-pA-Tn5蛋白,并检测其转座酶活性.方法 合成Flag-pA基因的DNA编码序列,PCR扩增后插入原核表达载体pTXB1-Tn5,构建重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5;转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达带有Flag标签的pA-Tn5蛋白,并经几丁质树脂亲和纯化后透析复性;将Flag-pA-Tn5蛋白与含测序引物接头的转座子DNA片段组装成转座体,取不同稀释比例的转座体与人外周血白细胞基因组DNA共孵育,以DNA孵育产物为模板、测序引物进行PCR扩增,鉴定Flag-pA-Tn5转座酶活性.结果 重组原核表达质粒pTXB1-Flag-pA-Tn5经双酶切和测序证明构建正确;表达的重组蛋白产量为211.1 μg/mL,能够被几丁质树脂亲和纯化,纯度为84％;Flag-pA-Tn5蛋白与转座子DNA片段组装后,能有效切割人外周血白细胞基因组DNA,并连接测序引物接头,具有转座酶活性.结论 获得了具有转座酶活性的重组Flag-pA-Tn5蛋白,为进一步利用Flag-pA-Tn5转座酶进行基因功能组学研究奠定了基础.

关键词：重组Flag-pA-Tn5转座酶、原核表达、几丁质树脂、酶活性

所属期刊栏目：35

分类号：R34(人体生物化学、分子生物学)

资助基金：国家自然科学基金;湖北省教育厅科学技术研究计划青年人才项目;安琪营养科研基金项目

在线出版日期：2022-10-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：1055-1059,1064