重组H5N1流感血凝素杆状病毒滴度荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

摘要：

目的 建立用于重组H5N1流感血凝素杆状病毒滴度检测的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用.方法 利用Bac-to-Bac技术构建重组穿梭质粒(rBacmid-H5),以其为模板,梯度PCR扩增H5基因,优化退火温度和引物浓度,建立qPCR检测方法,对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限.应用建立的qPCR方法对H5杆状病毒连续传代4次以及连续培养0～6d的样品进行检测,并与免疫荧光法进行比较.结果 在退火温度55℃,1 μL 10 mmol/L引物条件下,建立了qPCR法,该方法检测H5基因,专属性良好;模板浓度在1.15×103～4.25×109copies/μL之间,线性关系良好,R2=0.999;6次重复检测重组H5杆状病毒培养3d样品,RSD为1.01％,重复性较好.H5病毒连续传代4次,病毒滴度保持相对稳定,培养0～6d病毒滴度在第3天达到较高值,且检测值均高于免疫荧光法.结论 建立了qPCR法进行H5N1流感血凝素重组杆状病毒滴度的特异性检测.

关键词：荧光定量PCR法;甲型流感H5N1病毒;血凝素;杆状病毒;滴度

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分类号：R392-33

资助基金："重大新药创制"科技重大专项2013ZX09402302

在线出版日期：2021-11-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：1227-1231