双启动子双报告基因真核表达质粒的构建及鉴定

摘要：

目的 构建双启动子双报告基因真核表达质粒,并在293T细胞中表达,为筛选携带报告基因的肿瘤细胞系提供分子工具.方法 以质粒pcDNA3.1、pcDNA6-GFP、pSVA-Luc为模板,分别扩增CMV、GFP和Luc基因序列,通过In-fusion法将3个基因片段与经HindⅢ、Xho Ⅰ双酶切的pcDNA3.1载体连接,构建双启动子双报告基因重组真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP,转染293T细胞,荧光显微镜直接观察GFP的表达,化学发光仪检测Luc的表达.提取293T细胞总RNA,RT-PCR法扩增p53基因,通过In-fusion法将p53基因连接于质粒pC-T2A-Luc-GFP上,构建质粒pC-p53-T2A-Luc-GFP,转染293T细胞,Western blot法检测p53的表达,化学发光仪检测Luc的表达.结果 重组真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP经酶切及测序鉴定构建正确,GFP和Luc双报告基因均可在293T细胞中正确表达,且可用于后续的动物模型建立.pC-p53-T2A-Luc-GFP质粒中p53的插入降低了Luc的表达,但其表达仍为阳性,不影响Luc的正常检测.结论 成功构建了双启动子双报告基因真核表达质粒pC-T2A-Luc-GFP,并可在293T细胞中表达,为建立携带报告基因的肿瘤细胞系及肿瘤模型奠定了分子基础.

关键词：双启动子、双报告基因、绿色荧光蛋白、荧光素酶

所属期刊栏目：33

分类号：Q782(基因工程（遗传工程）)

资助基金：北京市博士后工作经费资助项目2018-ZZ-039

在线出版日期：2020-08-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：738-742,747