多聚磷酸盐激酶的原核表达、纯化及酶活性测定

摘要：

目的 原核表达、纯化多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinase,PPK),并检测其酶活性.方法 采用PCR法从尿路致病性E.coli CFT073中扩增ppk基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-ppk,转化感受态E coli BL21(DE3),IPTG诱导表达.重组蛋白经His-镍亲和层析柱分离纯化后,采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色法测定纯化蛋白的酶活性.结果 重组表达质粒pET-28a-ppk经双酶切及测序鉴定,证明构建正确.重组蛋白的相对分子质量约80 000,纯化后蛋白浓度为518.9 μg/mL.在加入10 μgPPK酶,37℃孵育30 min的条件下测得的PPK酶活性最大,为(645.16±32.98) U/mg.结论 成功在E.coli中表达了重组PPK,纯化产物纯度较高,具有PPK酶活性,为后续以PPK为靶点新型抗菌药物的研发奠定了基础.

关键词：多聚磷酸盐激酶、基因重组、蛋白表达、酶活性

所属期刊栏目：33

分类号：R34(人体生物化学、分子生物学)

资助基金：国家自然科学基金面上项目;广州市医药卫生科技一般引导项目

在线出版日期：2020-06-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：493-497