rTNSALP-FcD10重组表达质粒的构建及在CHO-K1细胞的稳定表达
目的 构建重组表达质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD 10及pEF 1-rTNSALP-FcD 10,获得能够稳定表达rTNSALP-FcD10蛋白的CHO-K1细胞株.方法 去除重组人非组织特异碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TNSALP)多钛链C端氨基酸连接IgG1的Fc片段及10个天冬氨酸,构建目的基因rhALP-FcD 10,将基因分别克隆至pcDNA3.1及pEF1/Myc-His B载体上,均转化E.coli DH5α细胞;将签定正确的两组重组质粒均转染CHO-K1细胞,进行G418压力筛选,建立稳定转染的CHO-K1细胞系,采用RT-qPCR及Western blot方法检测细胞中rTNSALP-FcD10 mRNA转录水平及蛋白表达量.结果 重组质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD10经双酶切鉴定证明构建正确;G418最低致死浓度确定为800 μg/mL;CHO-K1细胞中rTNSALP-FcD 10 mRNA转录及蛋白水平均高于空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.01);转染pEF1-rTNSALP-FcD10组的蛋白表达量较转染pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10组高.结论 成功构建了rTNSALP-FcD10的重组表达质粒pcDNA3.1-rTNSALP-FcD10及pEF1-rTNSALP-FcD 10,获得了稳定转染的CHO-K1细胞系,成功表达目的蛋白rTNSALP-FcD10,为蛋白进一步纯化奠定了良好的实验基础.
重组人非组织特异碱性磷酸酶、CHO-K1细胞、转染、稳定表达
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Q81(生物工程学(生物技术))
2019-06-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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