头孢菌素C乙酰化酶高通量筛选方法的改进
目的 改进头孢菌素C(cephalosporin C,CPC)乙酰化酶高通量筛选方法,获得催化活性显著提高的突变体.方法 基于对二甲氨基苯甲醛(p-dimethylaminobenzaldehyde,p-DAB)与7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid,7-ACA)的复合物在405 nm有最大吸收值的原理,采用无菌96孔深孔板对重组菌进行低温低浓度诱导剂诱导表达,再以含溶菌酶和DNase的缓冲液进行菌体裂解,最后以96孔板进行底物的水解和反应终止,经p-DAB显色后,利用酶标仪进行产物的快速定量,以实现CPC乙酰化酶突变体的高通量筛选.结果 利用改进的p-DAB比色法从先前建立的突变文库中筛选到2个在13℃下比酶活明显提高的突变子1A10和2G8,其比酶活分别为1.7和2.4 U/mg,较原酶的0.85U/mg显著提高.在优化的筛选条件下,A405的变化能够准确反映酶活性的大小,确保了该方法筛选结果的可信度.结论 改进的p-DAB比色法具有筛选快速,操作简便,筛选通量大及准确度高等优点,能够提高CPC乙酰化酶改造及筛选的效率,为低温CPC乙酰化酶的创制提供了技术支持.
头孢菌素C、乙酰化酶、高通量筛选、生物催化、比色法
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Q559+.3(酶)
河南省科技攻关项目162102210116;河南省高等学校重点科研项目计划15A416008;南阳师范学院专项项目ZX2015016
2018-03-26（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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