家蚕膜镁转运蛋白的表达及其纯化

摘要：

目的 在原核细胞中表达并纯化家蚕膜镁转运蛋白(Bombyx mori membrane magnesium transporter,BmMMgT).方法 利用PCR法从家蚕蚕蛹cDNA文库中扩增BmMMgT基因,对其进行生物信息学分析后,将该基因克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组克隆质粒pET-32a-BmMMgT,将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析柱和阴离子交换柱纯化后,进行SDS-PAGE鉴定.用无血清培养基(Mg2+饥饿)、镁离子终浓度分别为1、2、4、8 mmol/L的培养基培养BmN细胞,设正常培养基培养的BmN细胞作为对照,提取各组细胞总RNA,逆转录合成cDNA第1条链,以其为模板,荧光定量PCR检测体外Mg2+对BmMMgT基因mRNA转录水平的影响.结果 在cDNA文库中获得1个BmMMgT基因,该蛋白是一个单次跨膜蛋白,等电点为6.7,相对分子质量约13 000.质粒pET-32a-Bm-MMgT经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量为31 000,主要以可溶性形式存在,表达量约占菌体总蛋白的60％,纯度约95％.与对照组细胞相比,处在镁饥饿状态下及不同浓度MgCl2处理的细胞,BmMMgT基因mRNA转录水平差异均有统计学意义(P＜0.05),且当Mg2+终浓度为4 mmol/L时,转录水平达到最高.结论 成功在原核细胞中表达并纯化了BmMMgT,并对其功能进行了初步探讨,为其后续的深入研究奠定了基础.

关键词：家蚕、膜蛋白、镁转运蛋白、基因表达、纯化

所属期刊栏目：28

分类号：S881.2;Q78(蚕桑)

资助基金：国家高技术研究发展计划“863”项目2011AA100603.

在线出版日期：2015-07-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：570-574,578