磷酸酶张力蛋白同系物基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定
目的 构建携带磷酸酶张力蛋白同系物(phosphoatase and tensin homolog,PTEN)基因的shRNA重组腺病毒,并探讨其对犊牛肝细胞中PTEN基因mRNA表达水平的影响.方法 在Lipofectamine 2000介导下,将4个PTEN基因的pshRNA转染原代犊牛肝细胞,筛选转染效果最佳的pshRNA,将其克隆至重组穿梭载体pShuttle-EGFP-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-GFP-PTEN-shRNA,将构建正确的重组穿梭质粒及重组腺病毒骨架载体pAdxsi进行酶切并连接,构建重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PTEN-shRNA.将重组腺病毒质粒经PacI酶切线性化后,转染人肾K293细胞,包装重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-shRNA,经3轮扩增,测定病毒滴度.荧光定量PCR法检测重组腺病毒对犊牛肝细胞中PTEN基因mRNA表达水平的影响.结果 与空白对照组比较,pshRNA1和pshRNA3组中PTEN基因mRNA表达量分别下降了44％和68％(P＜0.05,确定pGPU6/GFP/Neo-PTEN-shRNA3为最佳转染质粒);重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-PTEN-shRNA经酶切鉴定证明构建正确,经包装和3轮扩增,重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-shRNA的滴度为1.2×1010 PFU/ml;转染Adxsi-GFP-PTEN-shRNA 48 h后,犊牛肝细胞中PTEN表达量为空白对照组和阴性对照组的42％和51％(P＜0.05).结论 成功构建了PTEN基因shRNA重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-shRNA,有效降低了犊牛肝细胞中PTEN的表达水平,为进一步探讨采用基因疗法防治奶牛脂肪肝奠定了基础.
磷酸酶张力蛋白同系物基因、RNA干扰、腺病毒、脂肪肝
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Q782;Q789(基因工程（遗传工程）)
国家自然科学基金30972224,31272629;黑龙江省自然科学基金C201323.
2015-05-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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