抗血管内皮生长因子鼠-人嵌合抗体真核表达载体的构建及在CHO DG44细胞中的表达
目的 构建抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠-人嵌合抗体真核表达载体,并在CHO DG44细胞中进行表达及初步鉴定.方法 分别采用鸡胚尿囊膜试验和小鼠肿瘤抑制试验检测鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5对VEGF促血管生成和肿瘤增生的抑制作用;采用RT-PCR法从鼠源性抗VEGF单克隆抗体的杂交瘤细胞2E5中扩增抗VEGF抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),利用IMGT数据库进行序列比对分析,筛选出功能性基因;采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE PCR)将VH基因与人IgGl重链恒定区基因连接,VL基因与人IgG1轻链恒定区基因连接,分别构建嵌合抗体重链基因和轻链基因,将嵌合的重链基因连入pOptiVECTM-TOPO(R) TA载体,轻链基因连入pcDNATM3.3-TOPO(R) TA载体,构建重链表达质粒pOptiVEC-H和轻链表达质粒pcDNA 3.3-L;采用脂质体法将重链和轻链表达质粒共转染CHO DG44细胞,经缺陷性培养基筛选和抗性标记筛选、MTX加压后,利用有限稀释法挑选单细胞株,ELISA法检测嵌合抗体的表达量;取批次培养的嵌合抗体细胞株上清液,经MabSelectSure亲和纯化和陶瓷羟基磷灰石纯化后,对纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE和高效液相色谱分析,并测定N-端序列、分子量和解离常数.结果 鼠抗人VEGF单克隆抗体2E5能抑制VEGF的促血管生成和肿瘤生长.嵌合表达载体pOptiVEC-H和pcDNA 3.3-L经菌落PCR及测序证实构建正确.经缺陷性培养基筛选、抗性标记筛选、MTX加压及单克隆筛选后,嵌合抗体的表达量可达68.5μg/ml.纯化的嵌合抗体纯度达99％以上;N-端测序结果与预期重、轻链N-端氨基酸序列一致;质谱法测定分子量为149 290;解离常数为2×10-9 mol/L.结论 成功构建了抗VEGF鼠-人嵌合抗体轻、重链表达载体,在CHO DG44细胞中表达了嵌合抗体,经层析纯化的嵌合抗体纯度较高,与VEGF抗原具有较强的亲和力,为后续进行抗VEGF单克隆抗体的人源化改造奠定了基础.
血管内皮生长因子、嵌合抗体、CHO细胞、纯化
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Q782;Q786(基因工程（遗传工程）)
国家重大新药创制课题2010ZX09401,2011ZX09306.
2015-01-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
1394-1399
