Sf9昆虫细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立
目的 建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量双抗体夹心ELISA检测方法.方法 从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的最适工作条件.确定该方法的最佳线性范围及最低检测限,验证该方法的准确度及精密度.将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性.与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性.结果 纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90％以上,抗体效价为1∶10000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合.建立的双抗体夹心法ELSA方法最佳抗体包被浓度为20 g/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值.该方法的最佳线性范围为50～1 600 ng/ml,最低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8％ ～ 117％之间,变异系数均小于10％;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品.结论 已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量.
Sf9昆虫细胞、宿主蛋白、双抗体夹心酶联免疫吸附测定
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R392-33
2014-06-23（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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