采用DoE设计方法优化可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体蛋白的聚乙二醇修饰工艺
目的 采用DoE设计方法对人可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(soluble tumour necrosis factor αreceptors Ⅰ,sTNFα-RⅠ)的聚乙二醇(PEG)修饰工艺参数进行优化,以期获得稳定、可控的工艺参数.方法 采用UNICORN(DoE)软件中Central Composite Face Centered(CCF)模型对sTNFα-RⅠ的3个PEG修饰工艺参数,即溶液pH值(pH)、反应时间(Time)和PEG与蛋白质量比(PEGrate)进行优化,设置4个响应值(多PEG修饰蛋白峰面积、单PEG修饰蛋白峰面积、未修饰蛋白峰面积及单PEG修饰蛋白峰面积与多PEG修饰蛋白峰面积比值)揭示其化学反应过程,确定参数操作空间;应用蒙特-卡罗模拟法(Monte-Carlo Simulation)对优化参数进行风险评估.结果 3因子17组试验结果的重复性较好,中心点重复组响应值介于最低值和最高值之间,且随机分布,符合DoE试验设计的要求;4个响应值所对应的回归系数(R2)均＞0.75,预测准确性(Q2)＞0.5,模型有效性(Model Validity)＞0.25,重复性(Reproducibility)＞0.5,模型预测与实验值之间偏差较小,具有可靠的预测准确性;17组试验结果标准残差在允许范围(-4～4)之间,线性较好,预测值与观测值之间相关性较好,建立的模型拟合度高,可较为准确地预测试验结果.溶液pH值对多PEG修饰产量影响较小,随着Time和PEGrate的升高,多PEG修饰产物增加,单PEG修饰产物经二次或多次修饰形成多PEG修饰产物,减少Time和PEG用量可减少多PEG修饰产物;单PEG修饰产物随着pH上升,产量有所增加,与Time呈二次项关系,在Time· PEGrate交互作用中,减少PEG用量可增加单PEG修饰产物量;减少Time和降低PEG用量可提高单PEG修饰产物与多PEG修饰产物的比值,有利于下游纯化.确定了工艺参数的操作空间,当pH为5.5时,反应时间控制在30 h以上,PEG与蛋白质量比控制在3.7以下,符合预设值;pH在6.5时,反应时间控制在22～35 h之间,PEG与蛋白质量比控制在2.5 ～4.0之间,符合预设值;蒙特-卡罗模拟法对在最佳操作参数(反应时间34.1h,溶液pH值6.5,PEG与蛋白质量比2.5)时模型预测的响应值(单PEG修饰产物峰面积值5 635.82和单PEG修饰产物与多PEG修饰产物比值3.226 5)的风险评估,10万次模拟试验可信度分别为99.825％和99.982％,试验风险较小,工艺可控.结论 确定了sTNFd-R Ⅰ蛋白PEG修饰稳健的工艺参数.
肿瘤坏死因子α、受体、PEG修饰、DoE
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Q503(一般性问题)
“十二五”重大新药创制专项基金2011ZX09506-007
2014-02-24（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共10页
1814-1822,1826
