基因治疗用pUC118-ski质粒DNA纯化工艺的建立及其质量控制
目的 建立基因治疗用pUC 118-ski质粒DNA的纯化工艺,并进行质量鉴定.方法 采用碱裂解法粗提质粒,PEG/MgCl2沉淀法初步纯化后,依次通过Sepharose 6 FF分子筛层析、PlasmidSelect Xtra亲和层析和SOURCE30Q离子交换层析纯化质粒DNA.纯化的质粒DNA经琼脂糖凝胶电泳分析超螺旋质粒的比例;紫外分光光度计测定质粒的A260和A280值,以A260/A280比值评价其纯度;CCK-8法检测质粒促原代培养的大鼠皮肤成纤维细胞的增殖活性;BCA法和鲎试剂凝胶法分别检测质粒DNA中残留的蛋白质和内毒素含量;PCR法检测质粒中细菌基因组DNA的含量.结果 经Sepharose 6 FF分子筛层析可有效去除质粒DNA中的RNA,经PlasmidSelect Xtra亲和层析能将超螺旋质粒DNA(scDNA)与开环质粒DNA(ocDNA)有效分离,经SOURCE30Q离子交换层析获得的质粒DNA纯度很高,但出现了少量ocDNA.获得的质粒DNA纯品中超螺旋质粒所占比例大于90.5％;纯度(A260/A280)为1.83;促原代培养的大鼠成纤维细胞的增殖活性与空载体组相比提高了22.9％ (P＜0.05),与纯化前的质粒促细胞增殖活性一致;内毒素含量小于50 Eu/mg;几乎检测不到蛋白质残留;细菌基因组DNA残留量小于1.2μg/mg.结论 建立了基因治疗用pUC 118-ski质粒DNA的纯化工艺,纯化产品的质量指标均符合国家食品药品监督管理局(SFDA)的标准,为申请该基因药物的临床试验及大规模制备质粒DNA奠定了基础.
ski基因、重组质粒、基因治疗、层析、质量控制
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Q819;R392-33(生物工程学(生物技术))
国家自然科学基金30801195;重庆市自然科学基金面上项目CSTC2011jjA10016
2013-11-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
共5页
1483-1487
