酿酒酵母甲酸脱氢酶在大肠杆菌中的高效表达、纯化及其酶学性质

摘要：

目的 克隆酿酒酵母甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase,FDH)基因,在大肠杆菌中表达、纯化重组蛋白,并进行酶学性质分析.方法 以酿酒酵母基因组DNA为模板,采用温度梯度PCR法扩增fdh基因,重叠PCR技术校正fdh中的移码突变,构建重组表达质粒pET-28a-fdh,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,分别采用37℃IPTG诱导、15℃IPTG诱导和37℃乳糖自诱导表达,镍金属螯合亲和层析纯化重组FDH蛋白,并分析重组FDH的酶学性质.结果 成功克隆了1 100 bp的fdb基因,碱基突变纠正了基因缺失和置换引起的编码错误;表达的重组FDH相对分子质量约为43 000,37℃乳糖诱导表达的重组FDH主要以可溶形式表达,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组蛋门比活为7.69 U/mg;重组FDH的最适反应温度和pH分别为30℃和7.5,热稳定性较好,米氏常数分别为:KmNAD+=49μmol/L,Km甲酸=4.5 mmol/L.结论 已在大肠杆菌中表达并纯化了重组FDH蛋白,为进一步研究酿酒酵母FDH,利用其构建NAD(P)H辅酶再生体系奠定了基础.

关键词：酿酒酵母、甲酸脱氢酶类、NADH、克隆、分子、基因表达

所属期刊栏目：24

分类号：Q786(基因工程（遗传工程）)

资助基金：863项目2007AA02Z225;生物反应器工程国家重点实验室项目2060204

在线出版日期：2011-10-18（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页码：761-765,774