生物素标记UTP及温度值对HCV细胞外聚合酶分子复制模型的影响

摘要：

目的研究建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的生物素标记UTP浓度及温度值,为筛选药物创造条件.方法使用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR,从我国HCV RNA阳性病人血清中扩增出HCV NS5b RNA聚合酶全长基因序列,构建原核表达载体pET-30a-NS5b.在多个载体中选取pET-30a作为表达载体,选择诱导表达条件.利用Ni2十金属离子螯和亲和层析将其纯化,对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究.利用96孔DNA-BAND培养板, 建立生物素标记检测HCV NS5b聚合酶活性的模型.结果测序及读码框架分析结果表明,已得到相关HCV NS5b RNA聚合酶全基因序列.在最佳表达条件下,诱导表达的融合蛋白(相对分子质量65 000),纯度大于92.83% HCV聚合酶活性集团完整.建立了细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的最佳生物素标记UTP浓度及温度值.结论 HCV 聚合酶得到高效表达和有效纯化,以及HCV聚合酶作用模板及温度的最佳条件分别为0.5 mmol/L及37℃.

关键词：丙型肝炎病毒、聚合酶、融合蛋白、原核表达、复制

所属期刊栏目：17

分类号：R3(基础医学)

资助基金：国家高技术研究发展计划863计划2001234021

在线出版日期：2004-06-04（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共4页

页码：87-89,92