布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶的克隆表达纯化及活性测定
目的 克隆布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶基因,并进行表达纯化及活性测定.方法 通过PCR方法从布氏锥虫细胞基因组中扩增出亮氨酰-tRNA合成酶(LeuRS)基因,依次克隆入pBS-T克隆载体及pET21a(+)表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)RIPL中通过条件优化后表达.表达产物用His-Bind亲和色谱纯化,并用免疫印迹进行鉴定.采用放射性同位素方法进行酶活性测定.结果 PCR扩增得到3.2 kb的DNA片段,重组质粒pET21a(+)/LeuRs经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确.表达的重组蛋白占菌体可溶性蛋白的20%,纯化后蛋白纯度迭85%.免疫印迹进行鉴定蛋白正确,酶活性测定计算出提纯物酶活性约为72 U/mL.结论 已成功克隆表达纯化出布氏锥虫亮氨酸-tRNA合成酶,并用放射性同位素方法进行了酶活性测定,这为下一步进行布氏锥虫亮氨酰-tRNA合成酶抑制物的设计和体外筛选奠定了良好的基础.
布氏锥虫、亮氨酰-tRNA合成酶、原核表达、纯化、酶活测定
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Q78(基因工程（遗传工程）)
2010-05-10（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
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