实时荧光环介导等温扩增技术检测土壤中的类鼻疽伯克霍尔德菌

摘要：

目的 结合荧光染料EvaGreen与环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)探索快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的可行性.方法 根据类鼻疽伯克霍尔德菌filc基因片段设计了LAMP引物,利用荧光染料EvaGreen建立实时荧光环介导等温扩增技术(real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification,RealAmp),优化反应条件,扩增产物经电泳鉴定.通过类鼻疽伯克霍尔德菌和其他致病菌验证特异性,比较RealAmp与普通LAMP技术的敏感度,并测定人工污染土壤模拟样本的检出限.结果 恒温63℃条件下,20～60 min即可完成RealAmp检测;利用该方法检测类鼻疽伯克霍尔德菌为阳性,其余致病菌如鼠疫杆菌、布鲁氏杆菌、大肠杆菌等13株参考菌株及蜱虫的DNA(含大量假单胞菌属细菌)呈扩增阴性;RealAmp技术检测类鼻疽伯克霍尔德菌核酸的灵敏度为102 CFU/mL,检测克隆株质粒的灵敏度可达101 copies/μL,比普通LAMP技术的灵敏度高10倍;人工污染土壤模拟样本RealAmp的检出限为4.4×101 CFU/g,且20 min左右即可判定结果;直接检测24份浓度为4.4×101 CFU/g～4.4×108 CFU/g的类鼻疽伯克霍尔德菌人工污染土壤样本,在检出限以上,检出率同荧光定量PCR一致.结论 该方法特异性强、灵敏度高,且可实时监测类鼻疽伯克霍尔德菌,有望成为快速检测类鼻疽伯克霍尔德菌的有效方法,增强抵御生物恐怖战争的能力.

关键词：类鼻疽伯克霍尔德菌、filc基因、快速检测、环介导等温扩增技术

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分类号：Q789(基因工程（遗传工程）)

资助基金：国家重点研发计划2017YFC1601503;中国载人航天预先研究项目010101;湖南教育厅重点课题15A165;南华大学大学生研究性学习与创新性实验计划20164890101;南华大学自然科学基金项目资助2018KYY266;衡阳市重点实验室项目2018KJ110

在线出版日期：2019-05-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共7页

页码：216-222