家养野猪源EMCV VP1基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立和应用

摘要：

目的 以原核表达的脑心肌炎病毒(EMCV)VP1蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测EMCV抗体.方法 应用原核表达载体pET-28a构建家养野猪源EMCV VP1基因的重组表达质粒,并在感受态细胞BL21中表达,将该重组蛋白纯化后作为包被抗原,建立间接ELISA标准化检测程序,并应用于临床检测.结果 经双酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒pET-28a-VP1构建成功,转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的VP1蛋白,该重组蛋白可被EMCV阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性;通过优化反应条件,确定抗原浓度为1.25 ug/mL、待检血清以1∶80倍稀释为最佳抗原包被浓度和待检血清最佳稀释度,5％脱脂乳作为封闭液,待检血清的最佳作用时间为37℃作用60 min,酶标抗体稀释度的最佳工作浓度和最佳作用时间分别为1∶8 000和37℃30 min,底物最佳显色时间为20 min,特异性强,敏感性较高,重复性良好;应用该间接ELISA方法分别检测河南省126个猪场送检的1 618份血清和527份PCV-2抗体阳性血清,发现阳性场检出率为65.87％,血清总阳性率为45.30％,不同规模和不同阶段猪群均存在EMCV感染,中小型猪场的阳性率显著高于规模化猪场,EMCV与猪圆环病毒2型的混合感染率高达75.14％.结论 应用原核表达的重组VP1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于检测EMCV抗体水平,临床检测结果填补了河南省EMCV血清流行病学监测的空白.

关键词：脑心肌炎病毒、VP1蛋白、原核表达、间接ELISA、临床检测

所属期刊栏目：32

分类号：R373(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：Henan Province University Science and Technology Innovation Team Support program14IRTSTHN015;National Natural Science Foundation of China No.31272567河南省高校科技创新团队支持计划14IRTSTHN015;国家自然科学基金委31272567

在线出版日期：2016-10-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共6页

页码：728-733