香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术研究

摘要：

目的 利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便、快速、特异、灵敏的香港海鸥型菌检测方法.方法 根据香港海鸥型菌16S rDNA的保守区域设计特异性引物和探针.用不同浓度、不同温度对反应体系引物浓度、探针浓度及退火温度进行优化.用添加已知量的香港海鸥型菌样本验证方法敏感性;用香港海鸥型菌以及大肠杆菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性和稳定性.结果 当25μL反应体系中上、下游引物(10 μmol/L)各为0.6 μL,探针(10 μmol/L)为0.4μL,模板DNA量为5.0 μL,反应条件:预变性95℃20 s,变性95℃10 s,退火57℃40 s,40个循环时,香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系[Ct=3.538×log(菌浓度)+13.56,r=0.999],方法的最低检测浓度达到36 cfu/mL.23株香港海鸥型菌检测Ct值均小于35,而104株非香港海鸥型菌检测Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线.隔天连续5d重复试验Ct值变异系数小于3.20件活鲤鱼、18件活草鱼香港海鸥型菌检测率实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法(P ＜0.01,X2=21.50).且后者所需时间为5d,前者仅需10h.结论 TaqMan实时荧光定量PCR法是一种快速简便、特异性强、灵敏度高的香港海鸥型菌检测方法,值得推广应用.

关键词：香港海鸥型菌、TaqMan MGB探针、实时荧光PCR

所属期刊栏目：32

分类号：R378(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：浙江省医药卫生科技计划项目No.2013KYB055资助 Supported by the Medicine and Health Science-technology Project of Zhejiang Province2013KYB055

在线出版日期：2016-08-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：160-164