巨噬细胞通过下调miR-20a诱发凋亡促进结核菌清除的机制

摘要：

目的 探讨上调或下调巨噬细胞中miR-20a对结核菌诱导的细胞凋亡以及细菌清除的影响,鉴定结核免疫干扰新靶点.方法 构建表达miR-20a-5p、miR-20a-5p-inh且含绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体,用无血清转染试剂稀释,在5 μg/mL聚凝胺存在下以感染复数(MOI)为10转染人单核细胞株THP-1细胞3h,72 h后通过流式细胞仪筛选出GFP+细胞,佛波脂(PMA)刺激24 h后分化为巨噬细胞;结核分枝杆菌灭活菌(H37Ra)或过氧化氢(H2O2)处理细胞后,进行荧光素PE标记的膜联蛋白(Annexin)V和7-氨基放线菌素D(7AAD)染色15 min,流式细胞术检测Annexin V(+)和Annexin V(+)7AAD(+)细胞早晚期凋亡情况,方差分析(ANOVA)和多重比较试验(Newman-Keuls)分析细胞间凋亡率的差异;H37Ra以MOI为10感染巨噬细胞30 min,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次后放入CO2培养箱,3d后收集裂解物并接种到含10％ OADC增菌液的7H11琼脂平板上,37℃培养箱培养3～4周后使用标准程序重复三次计算细菌菌落数.结果 成功构建miR-20a-5p 、miR-20a-5p-inh慢病毒载体以及稳定促进或抑制miR-20a表达的细胞株;流式细胞术检测显示:在未刺激情况下细胞早、晚期凋亡的差异不明显,H37Ra或H2O2刺激后,细胞早、晚期凋亡率发生明显变化,以晚期凋亡率显著增加为主;方差分析和多重比较试验提示:在未刺激情况下过表达或抑制miR-20a,细胞凋亡率无显著差异,H37Ra或H2O2刺激后在miR-20a过表达时细胞凋亡率无明显变化,抑制miR-20a的表达细胞凋亡率显著增加;H37Ra感染巨噬细胞后收集细胞裂解物并接种到平板中培养,miR-20a过表达的细胞内结核菌存活率较高,抑制miR-20a表达结核菌的存活率下降.结论 结核菌感染巨噬细胞后,宿主通过下调miR-20a诱发细胞凋亡进而清除结核菌.

关键词：微小RNA、细胞凋亡、结核分枝杆菌

所属期刊栏目：18

分类号：R378.98+1(医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学）)

资助基金：十三五传染病重大专项2017ZX10103004;国家自然科学基金81501714;深圳市科技计划项目JCYJ20160427153348709,JCYJ20170412151620658,JCYJ201703070950030518

在线出版日期：2018-08-27（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共5页

页码：523-527