利用酵母双杂交系统筛选与辣椒轻斑驳病毒126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子

摘要：

[目的]辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)是世界范围内危害辣椒的主要病毒之一.126 kDa蛋白是PMMoV编码的重要致病因子,但致病机制目前仍不清楚.本研究旨在筛选与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子,为解析PMMoV的致病机制提供理论依据.[方法]首先,通过同源重组法构建诱饵载体pGBK-126 kDa;并以辣椒叶片为试验材料,利用Trizol法提取辣椒叶片总RNA,制备辣椒酵母cDNA文库;之后,使用pGBK-126 kDa对cDNA文库进行筛选,并通过NCBI和Uniprot等对筛选结果进行序列比对和生物信息学功能分析,根据比对分析结果,选取可能参与到植物抗病通路的寄主因子,克隆其全长CDS构建到pGADT7 载体,酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和荧光素酶互补(LCI)进一步验证126 kDa与寄主因子之间的互作;最后,通过瞬时过表达寄主蛋白分析其在PMMoV侵染过程中的作用.[结果]提取获得高质量辣椒RNA,无降解;获得高质量酵母cDNA文库,成功构建诱饵质粒pGBK-126 kDa,筛选得到与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子 18 个;生物信息学分析结果显示,18 个寄主因子广泛参与到植物酶系统、物质及能量代谢调节过程、DNA结合转录过程、激素合成过程以及防御响应等多个通路;选取的其中3个寄主因子(LA2、PDHE1、BXL1)在一对一酵母双杂交互作验证中均存在与126 kDa的相互作用,表明初筛的结果可靠;通过BiFC和LCI进一步验证了126 kDa与BXL1之间体内外互作;瞬时过表达BXL1 发现PMMoV的侵染受到了显著抑制.[结论]成功构建了pGBK-126 kDa诱饵质粒,基于该质粒对酵母cDNA文库进行筛选得到18个互作的寄主因子,广泛涉及植物生命活动过程中的多个通路,筛选结果验证可靠,其中,BXL1存在与126 kDa的体内外相互作用,并能够抑制PMMoV的侵染.研究结果可为深入探究PMMoV的侵染机制提供良好的理论和材料基础.

关键词：辣椒轻斑驳病毒、辣椒、酵母双杂交、126 kDa蛋白、致病机制

所属期刊栏目：57

分类号：Q78;R373;Q51

资助基金：国家自然科学基金;安徽省自然科学基金优青项目;安徽省高校优青基金

在线出版日期：2024-08-29（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：2986-2996