柑橘黄化花叶病毒的实时定量PCR检测及其在寄主植株中的时空分布规律

摘要：

[背景]柑橘黄化花叶病毒(citrus yellow mosaic virus,CYMV)是首先发现于印度并对其柑橘产业造成严重危害的一种杆状DNA病毒.目前,CYMV已被美国、日本、新西兰、欧洲和地中海地区列入检疫性有害生物名单,具有传入我国的潜在风险.[目的]建立 CYMV 的实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测体系;筛选 CYMV敏感柑橘品种;明确CYMV在寄主植株中的时空分布规律,为该病毒的监控提供技术支持.[方法]根据NCBI中CYMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列,利用软件Primer Premier 5 设计qPCR检测引物 8 对,通过常规PCR筛选扩增效果好、特异性强的引物.通过对引物浓度、退火温度等反应条件优化,建立 CYMV 的 qPCR 检测体系,并进一步通过对不同柑橘病原的检测评价所建体系的特异性;以梯度稀释的 1.98×109-1.98 copies/μL的质粒标准品平行进行常规PCR及qPCR检测,评价所建方法的灵敏度;随机采集田间柑橘样品,平行进行常规PCR及qPCR检测,评价所建方法的适用性.将CYMV接种到玉环柚(Citrus grandis)、强德勒柚(C.grandis)、22 号枳(Poncirus trifoliata)等 15 个柑橘品种,进行症状观察和分子检测以筛选敏感指示植物.在接种后不同时间,分别自MV甜橙(C.sinensis)植株不同组织部位取样,以柑橘生长因子 1α基因为内参基因,利用所建体系进行qPCR检测,从而明确CYMV在寄主植株中的时空分布规律.[结果]建立了CYMV的qPCR检测体系,其最佳引物为CYMV-qF7/R7,最佳引物浓度为 200 nmol·L-1,最佳退火温度为 63℃.该检测体系的特异性强,检测灵敏度是常规PCR的 1 000 倍.对来自不同地区的 660 个田间柑橘样品的检测结果表明,qPCR检测与常规PCR检测结果一致,除阳性对照外均未检测到CYMV阳性植株.不同柑橘品种接种试验结果表明,15 个柑橘品种中,玉环柚和强德勒柚最早表现出强烈的黄化花叶典型侵染症状,可以作为敏感指示植物.qPCR检测结果表明,老叶中的 CYMV 滴度最高,老皮和根病毒滴度较高,嫩皮中的滴度较低.CYMV 在植株中的相对含量,7-9 月最高,此后逐月下降,并在次年 1 月达到最低值,从次年 2 月开始,CYMV的相对含量开始上升,与环境温度变化趋势一致.[结论]建立了特异性强、灵敏度高的CYMV实时荧光定量PCR检测方法,利用该方法明确了CYMV在寄主植株中的时空分布规律.此外,玉环柚和强德勒柚可作为CYMV敏感指示植物.

关键词：柑橘黄化花叶病毒、实时荧光定量PCR、时空分布

所属期刊栏目：56

分类号：R734.2;S852.65;R372

资助基金：国家重点研发计划;重庆市自然科学基金

在线出版日期：2023-10-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：3574-3584