大豆根瘤菌菌株5873 PCR快速检测方法的建立及应用效果评价

摘要：

[目的]大豆根瘤菌(Bradyrhizobium j aponicum)是微生物肥料重要的功能菌种之一,可通过生物固氮为大豆生长提供氮素,实现节本增效,菌株 5873 作为其典型代表,已广泛应用于农业生产.筛选并鉴定其特异引物,建立大豆根瘤菌5873菌株水平的快速检测方法,对微生物肥料生产菌种鉴定、产品质量检测和功能评价至关重要.[方法]以商业化菌株大豆根瘤菌5873 为供试材料,基于其全基因组序列和NCBI数据库中大豆根瘤菌种内参比菌株相关序列,以及与其高度同源(基因组ANI值大于99.95%)的大豆根瘤菌USDA 6T差异片段,通过多重序列比对,进行特异引物设计和筛选,获得特异性引物对,并通过对PCR反应条件/体系优化、特异性及灵敏度检测,建立大豆根瘤菌5873的快速检测方法.然后,采用盆栽试验,将大豆根瘤菌5873与其他根瘤菌菌株混合接种于大豆根际,应用上述方法对大豆根瘤菌5873竞争结瘤能力进行评价和方法验证.[结果]筛选获得了一组特异引物4-4和Q1(4-4-F 5′-GATAAGGCCACGGGTGAACA-3′/4-4-R 5′-CACTCGATAAGCTCCGCTGT-3′和Q1-F 5′-CCGGTCGTGACTGGAATGAT-3′/Q1-R 5′-TCGAGGCCTACAAGAACGTC-3′),优化并建立了PCR快速检测方法,即反应体系:Premix TaqTM 12.5 μL,引物各 1.0 μL,基因组DNA 15 ng左右,加ddH2O补足至 25 μL;反应条件:95℃预热 5 min,94℃变性 45 s,61℃退火 45 s,72℃延伸 60 s,30 个循环,再 72℃延伸 10 min.通过凝胶电泳检测目的条带的有无(355 和 218 bp),即可实现大豆根瘤菌 5873 的快速检测,该方法检出灵敏度为 1850 CFU/μL.此外,借助该方法可以成功地评价大豆根瘤菌 5873 竞争结瘤能力,与传统BOX-PCR评价结果一致.[结论]大豆根瘤菌 5873 快速鉴定方法的建立实现了以菌体发酵液或根瘤破碎提取液为模板,直接进行PCR扩增的鉴定操作,省去了根瘤的分离、根瘤菌分离纯化、培养、DNA提取及测序鉴定等繁琐的环节,大大减少了工作量,只需短短几个小时便可准确检测大豆根瘤菌5873,为微生物肥料中根瘤菌菌剂的产品质量检测和竞争结瘤能力评价提供了参考.

关键词：大豆根瘤菌、特异引物、PCR扩增、竞争结瘤

所属期刊栏目：56

分类号：S144;Q94;S858.31

资助基金：国家重点研发计划;云南省重大科技专项计划;现代农业产业技术体系

在线出版日期：2023-08-14（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：2751-2760