高效GFPuv荧光筛选基因编辑载体的改造及其在马铃薯遗传转化中的应用

摘要：

[目的]转基因技术的发展离不开筛选标记的完善与创新,其中的可视化筛选标记在转基因中的应用越来越广泛.近年来,经过突变获得的增强型黄绿荧光蛋白(an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein(eYGFP)under ultraviolet(UV),eYGFPuv(GFPuv))在365 nm紫外光线下能够发出强烈且稳定的绿色荧光,便于观察.构建GFPuv荧光筛选的基因编辑载体,并在马铃薯遗传转化中进行应用验证,为GFPuv荧光筛选在马铃薯转化中广泛应用提供技术支持,同时为后期利用基因组编辑技术创制马铃薯雄性不育系奠定基础.[方法]利用同源重组技术将GFPuv表达框架和基因编辑元件Cas9_sgRNA依次与pCAMBIA2300载体连接,并进行农杆菌介导的烟草瞬时转化试验;通过发根农杆菌Ar qual和MSU440转化马铃薯茎段,在便携紫外灯下观察,并统计荧光根;利用改造载体构建了6个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体,通过发根农杆菌体系转化 2 种马铃薯材料,验证转化效率和编辑效率;利用改造载体对马铃薯进行遗传转化.[结果]成功构建了GFPuv荧光筛选的基因编辑载体pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas,瞬时转化烟草证实GFPuv表达框架能正常表达;2 种发根农杆菌的转化均筛选到绿色荧光的毛状根,加入卡那霉素(kanamycin,Kan)显著提高阳性荧光根的比例,2种菌的转化效率差异不大,但MSU440 的发根形成速度更快;6 个马铃薯花药发育保守基因的编辑载体在 2 种马铃薯材料中的转化效率和编辑效率是一致的,但不同靶位点的编辑效率差异较大;改造载体遗传转化马铃薯证实GFPuv荧光可用于马铃薯愈伤组织和再生苗的筛选.[结论]发根农杆菌遗传转化体系是基因编辑效率验证的重要途径,GFPuv荧光可用于马铃薯转化的筛选.

关键词：马铃薯、GFPuv、基因组编辑、毛状根、遗传转化

所属期刊栏目：56

分类号：S513;Q782;S

资助基金：国家重点研发计划;中国博士后科学基金面上项目;云南自然科学研究计划杰出青年项目;中央引导地方科技发展资金

在线出版日期：2023-07-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共14页

页码：2223-2236