猪腹泻病毒一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法的建立及应用

摘要：

[目的]建立一种可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)野毒株、猪A群轮状病毒(GARV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪阿尔法冠状病毒(SADS-CoV)及猪捷申病毒(PTV)5种猪腹泻病毒的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测法.为猪腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供高效灵敏的工具.[方法]对PEDV多个基因型毒株ORF3基因比对分析,以PEDV野毒株为模板,对疫苗株ORF3基因稳定缺失区域设计特异性探针,并在两端保守区域设计上下游引物;在靠近GARV G3、G4、G5和G9型NSP5基因5′端保守碱基区域设计引物及探针,并加入简并碱基.同时,分别选择PDCoV M基因、PTV 5′UTR序列、SADS-CoV N基因等保守基因设计特异性引物及探针,用于多重荧光定量PCR方法的建立.对引物、探针浓度和退火温度进行优化;用RStudio参照代码绘制ROC曲线,确定检测方法的敏感度值、特异度值及曲线下面积AUC,并计算Youden指数,最终确定检测临界值;从阳性核酸中扩增靶基因,并克隆至pEASY-T1载体.通过体外转录,获得5种标准品分别命名为:cRNA-PEDV、cRNA-GARV、cRNA-PDCoV、cRNA-PTV和cRNA-SADS-CoV.对检测方法的敏感性、特异性和重复性等进行评估;并与同类方法对临床样本的检测符合率进行比较.[结果]得到了5种病原检测的最佳引物、探针浓度和最佳退火温度.根据ROC曲线确定PEDV、GARV、PDCoV、PTV和SADS-CoV临界CT值分别为:35.78、34.25、34.98、34.60和35.70;5种病原的检测下限均可达到1×102 copies/μL,标准曲线线性关系良好,扩增效率在96.3％—104％之间;该方法对PEDV CV777疫苗株、PEDV AJ1102疫苗株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌(S.suis)和葡萄球菌(S.aureus)等多种菌毒株均不检出,具有良好的特异性;经重复性检验,组内变异系数在0.22％—3.08％之间,组间变异系数在0.89％—4.0％之间;对242份临床样本检测并与同类方法的检测结果进行比较,符合率分别为:PEDV 97.9％、GARV 98.8％、PDCoV 100％、PTV98.3％和SADS-CoV100％,Kappa值均大于0.9.对PEDV野毒株的检测准确性高于同类方法.此外,对临床样本检测结果显示,当前四川省腹泻猪群中尚无SADS-COV检出;但PEDV、GARV、PDCoV和PTV仍持续流行,其总体阳性率分别达到:10.7％(26/242)、13.6％(33/242)、18.2％(44/242)和14.5％(35/242),且各腹泻病原之间存在不同形式和程度的混合感染,使感染猪腹泻病情加剧.故需进一步加强几种猪腹泻病毒在本地区猪群中流行情况调查和遗传变异规律研究,为制定更具针对性的防控措施提供依据.[结论]本研究成功建立了一种同时检测PEDV野毒、PDCoV、SADS-CoV和GARV、PTV多基因型的一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR,为猪腹泻病的快速鉴别诊断和流行病学调查提供了一种高效灵敏的工具.

关键词：一步法多重TaqMan荧光定量RT-PCR、猪腹泻相关病毒、鉴别诊断、检测临界值

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分类号：S858.28;R733.7;R392.1

资助基金：中央高校基本科研业务费专项2020NQN29

在线出版日期：2023-02-20（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共14页

页码：179-192