柑橘黄化花叶病毒侵染性克隆构建及应用

摘要：

[目的]构建柑橘黄化花叶病毒(citrus yellow mosaic virus,CYMV)侵染性克隆,为深入研究其分子特性及致病机理打下基础.[方法]利用In-Fusion同源重组技术将分段扩增的CYMV基因组序列与三元表达载体pCY重组连接,构建该病毒1.4倍基因组全长DNA克隆并开展序列分析.将所获克隆通过农杆菌介导接种尤力克柠檬实生苗,通过分子检测、症状和病毒粒子观察及再嫁接实验鉴定其侵染性.利用所获侵染性克隆接种不同的柑橘品种及草本植物,通过RT-PCR检测确定侵染率,观察不同柑橘品种受侵染后的症状差异.基于侵染性克隆构建ORF Ⅰ和ORF Ⅱ分别替换为绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,gfp)的突变体,分析突变对病毒侵染性的影响.[结果]利用In-Fusion同源重组技术获得CYMV 1.4倍基因组全长DNA克隆7个.其中,CYMV-3与已登录GenBank的9个CYMV分离株基因组相应核苷酸序列一致性为90％-100％,与分离株CYMV-SO(AF347695)同源性最高并在遗传进化树上聚为一簇.侵染性鉴定结果表明,CYMV-3接种的14株尤力克柠檬植株中有4株呈RT-PCR阳性,并观察到点状褪绿症状;提取侵染植株系统新叶DNA,PCR扩增获得预期的覆盖CYMV基因组全长的特异性片段;以CYMV-3侵染显症植株为毒源嫁接接种粗柠檬实生苗,通过RT-PCR在90dpi可检测到CYMV特异性条带;取CYMV-3侵染显症植株的新叶进行固定切片并电镜观察,可见大小约130nmx30nm的杆状病毒粒子,说明CYMV-3为CYMV侵染性克隆.将CYMV-3通过农杆菌介导真空浸润接种10个柑橘品种,注射接种5个柑橘品种并进行RT-PCR检测,结果显示前者侵染率为11.11％-100.00％,后者侵染率为63.16％-90.00％,部分柑橘品种出现黄化、花叶、斑块状黄化等CYMV侵染症状.通过农杆菌介导注射接种本氏烟、玉米、豇豆和高粱,结果显示仅高粱检测到RT-PCR阳性植株,且系统叶片沿叶脉周边出现条状褪绿带,表明CYMV可以侵染高粱.构建了 CYMV-3 ORF Ⅰ和ORF Ⅱ分别替换为gfp的突变体,通过农杆菌介导注射接种粗柠檬,RT-PCR检测结果均为阴性,且无侵染症状.[结论]成功构建了 CYMV的侵染性克隆,通过农杆菌介导注射可高效接种柑橘植株,侵染症状在不同品种上具有差异.

关键词：柑橘黄化花叶病毒、侵染性克隆、农杆菌介导接种、突变体

所属期刊栏目：55

分类号：R282.5;G642;G717

资助基金：国家重点研发计划;重庆市自然科学基金

在线出版日期：2023-02-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共11页

页码：4840-4850