绿僵菌mad2敲除株构建及其生物学和诱导植物响应的功能分析

摘要：

[目的]昆虫病原真菌绿僵菌兼具植物内生性.已知黏附素MAD2是绿僵菌两种黏附蛋白之一,在实现绿僵菌与植物的黏附、定殖中起重要作用,但其作用机理知之甚少.本研究通过构建金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)mad2敲除突变株(△mad2),探究MAD2蛋白对绿僵菌生物学功能的影响.[方法]从NCBI中获取mad2前后基因组DNA序列,设计扩增mad2前后同源臂特异性引物,以绿僵菌基因组DNA为模板,扩增得到前后同源臂基因S1、S2;设计特异性引物Hyg-F/R,以pKH-KO载体为模板,扩增得到带有启动子序列的潮霉素基因hyg;,再通过overlap PCR构建mad2的同源敲除金S1H、S2H;最后利用PEG介导的原生质体转化,获得稳定遗传的mad2敲除株.通过对比敲除株与野生株(WT)的生长特性、黏附作用、杀虫毒力以及诱导花生共生基因转录水平的变化,分析MAD2蛋白的生物学功能.[结果]原生质体转化获得了敲除mad2的同源重组转化子;敲除株与野生株对比分析表明,敲除株的孢子萌发率显著低于野生株,萌发中时间比野生株延长5.47 h;培养12h和14h时,敲除株的菌丝长度显著均小于野生株,分别为野生株的77.8％和76.3％;培养12 d的产孢量也比野生株减少33.3％.敲除株对洋葱内表皮的黏附力明显降低,但对蝗虫后翅的黏附性无显著影响.敲除mad2并不影响绿僵菌对家蚕的毒力.敲除株处理花生12h后,与野生株处理相比,花生共生受体SYMRK、钙信号解码相关基因(CaM、 CCaMK和DELLA)、脂质氮素转运相关基因(LTP1、NRT24、ABCC2)的转录水平出现显著下调;而与空白对照相比,mad2缺失后SYMRK转录水平仍有一定的上调,CaM、 CCaMK和DELLA的转录水平产生显著抑制,对ABCC2、LTP1、NR724的转录无明显影响.[结论]金龟子绿僵菌黏附素MAD2影响菌株的孢子萌发、早期菌丝生长、产孢及对植物的黏附力,但对昆虫的黏附和杀虫毒力无影响;在菌株与花生互作早期,MAD2触发了花生共生基因的转录.

关键词：金龟子绿僵菌;黏附素MAD2;基因敲除;黏附性;杀虫毒力;生长特性

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资助基金：国家重点研发计划;国家科技基础资源调查专项;国家引才引智示范基地

在线出版日期：2021-12-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：4800-4812