绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答

摘要：

[目的]克隆绿盲蝽( Apolygus lucorum )雷帕霉素靶标全长基因( AlTOR ),研究AlTOR时空表达特性及在外源蜕皮激素(20E)诱导下的应答响应,进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体,分析该抗体的特异性,为后续研究AlTOR蛋白功能打下基础.[方法]RACE法克隆AlTOR基因序列全长,qRT-PCR分析AlTOR表达特性以及在20E及其抑制剂U73122诱导下的应答响应;将含有AlTOR序列T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建原核表达载体pCzn1-AlTOR,经20℃、0.5 mmol·L-1 IPTG诱导表达、变性、复性和蛋白纯化后,以获得AlTOR重组蛋白,最后再通过免疫,制备AlTOR蛋白多克隆抗体,Western blot 评价该抗体的特异性.[结果]AlTOR的开放阅读框编码包含 435 个氨基酸,具有典型的TOR基因序列特征,即 SIN1结构域、高度保守的CRIM结构域及PH域; AlTOR在绿盲蝽不同日龄、不同组织中均有表达,且在1日龄以及脂肪体中表达量最高;20E可诱导绿盲蝽不同日龄若虫期AlTOR的表达,同时也能诱导成虫头、翅、卵巢和脂肪体中AlTOR表达上调,分别上调200.00%、118.89%、20.53%和60.82%,而U73122在中肠和卵巢中会显著抑制AlTOR的表达.经双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pCzn1载体上,命名为pCzn1-AlTOR;IPTG诱导的重组质粒可特异性表达一个约36 kD的蛋白,且主要以包涵体形式存在;经Ni-IDA亲和层析纯化后,仅在36 kD附近有一条明显的特异性条带.进一步免疫及间接ELISA方法确定抗血清对TOR蛋白的效价,Western blot分析表明制备的多克隆抗体可以特异性与AlTOR重组蛋白及绿盲蝽3龄若虫总蛋白结合,说明制备的AlTOR多克隆抗体特异性较好,可以用于后续的蛋白研究.[结论]AlTOR在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;20E及其抑制剂诱导后, AlTOR呈现出相反的应答反应;本研究获得的AlTOR重组蛋白的多克隆抗体具有高特异性.

关键词：绿盲蝽、雷帕霉素靶标、基因克隆、蜕皮激素、多克隆抗体、表达

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分类号：R730.2;R392.11;S852.65

资助基金：国家重点研发计划;现代农业产业技术体系建设专项;国家自然科学基金;转基因棉花环境安全性评价技术;江苏省农业科学院院基金项目

在线出版日期：2021-05-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共14页

页码：2118-2131