针对非洲猪瘟病毒MGF360-13L基因的TaqMan荧光定量PCR的建立

摘要：

[目的]建立一种以MGF360-13L基因为靶标的实时荧光定量PCR检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的方法,为非洲猪瘟(African swine fever,ASF)的诊断、MGF360-13L基因缺失毒株鉴别、病毒分离鉴定、基因功能研究提供技术支持.[方法]首先,以ASFV中国流行毒株(GenBank:MK333180.1)的MGF360-13L基因序列为靶标设计并筛选了1对特异性引物和探针,建立其荧光定量PCR检测方法.设计引物13L-F/13L-R,扩增MGF360-13L,并将其克隆至p0K12载体,挑取阳性克隆并测序验证,构建重组质粒标准品.将重组质粒标准品连续10倍梯度稀释,以稀释后的各梯度质粒标准品为模板,配制反应体系和设置反应条件后进行荧光定量PCR检测,建立标准曲线,并对其敏感性和重复性进行评价;其次,以连续10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板,利用引物13L-F/13L-R进行常规PCR检测,以比较荧光定量PCR的敏感性.最后,运用本检测方法和本研究组已建立的针对ASFVp72的荧光定量PCR检测方法同时对黑龙江某猪场发生ASF时采集的30份临床样品进行检测,以比较两种检测方法的符合率.另外,应用该方法对感染原代巨噬细胞的ASFV野毒株和MGF基因缺失毒株进行鉴别检测.[结果]利用引物13L-F/13L-R可扩增出一条800bp左右的特异性目的条带,而阴性对照无条带,成功构建出标准品.本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法在质粒标准品为1.56×101-1.56 ×108拷贝/μL时,呈现出良好的线性关系,线性回归方程为:y =-3.295 lg(x)+45.995,线性相关系数R2为0.997,对ASFV核酸最低检测限为15.6拷贝/μL.在特异性检验中,除ASFV核酸外,猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型等病毒核酸均未出现扩增曲线,表明该方法的特异性良好.与最低检测限为1.56 ×104拷贝/μL病毒核酸的常规PCR检测方法相比,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法高出其约3个数量级,具有较高的敏感性.在临床样品检测中,两种检测方法经过McNemar检验,P= 0.5 ＞0.05,表明两种检测方法的结果无统计学差异;经过Kappa检验,Kappa = 0.867 ＞0.75,P＜ 0.001,提示两种检测方法符合率较好,能够有效区分ASFV野毒株和MGF360-13L基因缺失毒株.[结论]建立的TaqMan荧光定量PCR特异、敏感、重复性好,不仅丰富了ASFV现有检测靶标,也为后续MGF360-13L功能、MGF缺失毒株的鉴定及相应基因缺失疫苗株的鉴别诊断提供技术支持.

关键词：非洲猪瘟病毒、MGF360-13L、荧光定量PCR、鉴别诊断

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资助基金：国家重点研发计划项目2017YFD0502300

在线出版日期：2021-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共8页

页码：1073-1080