rhPA/GH双转基因兔的制备及rhPA表达检测

摘要：

[目的]双基因共整合可协同促进转基因生物的目的基因表达水平提高,研究获得rhPA/GH双转基因兔,并比较分析目的基因rhPA的表达水平及兔个体生长发育情况,为制备高表达rhPA转基因动物和遗传育种提供新思路.[方法]利用NotI/SalI双酶切PCL25/GH质粒和QIAGEN DNA胶纯化试剂盒回收显微注射用基因片段.以3只rhPA单转基因兔(标号K06、K10、K17)作为供体兔,通过FSH/hCG超数排卵、受精卵原核显微注射、胚胎移植、苯酚/氯仿抽提新生仔兔耳尖组织基因组、PCR整合检测等方法获得rhPA/GH双转基因兔.经ELISA和Western blotting对转基因兔乳清进行表达检测,比较分析单、双基因表达rhPA水平.测量不同月龄的转基因兔体重,通过监测双转基因兔不同生长阶段的体重来分析GH对兔生长发育的影响.[结果]成功获得了约16700 bp大小的显微注射用基因片段,共超排3只供体兔获得122枚卵,其中103枚受精卵,受精率为84.4％(103/122),显微注射后挑取形态较好的81枚移植6只同步发情受体兔,5只兔怀孕,妊娠率为83.3％(5/6),妊娠到期共出生32只仔兔.通过PCR检测鉴定有19只携带rhPA基因的转基因兔,其中有11只rhPA/GH双转基因兔(7♂,4♀),双基因整合率为34.4％(11/32),且4只rhPA/GH双转基因母兔来源亲代分别为K06供体兔2只(标号K06-1、K06-2)、K10供体兔1只(标号K10-1)、K17供体兔1只(标号K17-1).K06号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.2μg·mL-1,K06-1和K06-2号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量分别为432、444μg·mL-1;K10号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为42.8μg·mL-1,K10-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为636μg·mL-1;K17号rhPA单转基因兔乳清中rhPA表达量为15.2μg·mL-1,K17-1号rhPA/GH双转基因兔乳清中rhPA表达量为248μg·mL-1.4只rhPA/GH双转基因母兔(K06-1、K06-2、K10-1、K17-1)乳腺表达rhPA含量在248-636μg·mL-1之间,远远高于rhPA单转基因母兔(K06、K10、K17)乳腺的表达含量(15.2-42.8μg·mL-1),表达水平显著提高了约10.2-16.3倍,说明GH能够协同促进目的基因rhPA在转基因兔乳腺中的表达水平.Western blotting结果显示出现一约39.0 kD大小的条带,与目的蛋白rhPA大小相同,进一步证明转基因兔乳腺中表达的这种蛋白为目标产物rhPA.对rhPA/GH双转基因兔从出生到6个月的体重进行连续测量,发现与正常非转基因兔的体重没有明显的差异,绘制生长曲线进一步表明4只整合GH的转基因兔与2只未整合GH的正常兔在生长发育的不同阶段体重上没有显著性差异,成长至6个月的体重均在4.0-5.0 kg之间,这证明GH的导入并不影响转基因兔的存活和正常生长发育至成年.[结论]成功地制备了rhPA/GH双转基因兔,并证明了GH基因的导入能够显著地提高目的基因rhPA的表达量,且不会对转基因兔的生长发育产生影响,这为将来制备高表达转基因兔及其它动物奠定了基础,也为转基因动物乳腺生物反应器和转基因育种建立提供了新思路、新方法.

关键词：双转基因兔、表达、超数排卵、显微注射、生长曲线

资助基金：江苏省高校自然科学基金面上项目;国家转基因生物新品种培育重大专项

在线出版日期：2021-02-25（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：412-421