藤茶查尔酮合成酶基因AgCHS1的克隆及功能鉴定

摘要：

[目的]查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是植物类黄酮生物合成的第一个关键酶,从藤茶中克隆AgCHS1,分析其序列特征及其在藤茶中的组织表达特异性,通过体外酶活性检测和烟草遗传转化对其功能进行鉴定,为进一步研究藤茶类黄酮累积的调控机理提供理论基础.[方法]根据藤茶转录组测序结果设计引物,以藤茶叶片cDNA和基因组DNA为模板,PCR扩增得到AgCHS1.利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA6和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建系统进化树.通过原核表达系统获得AgCHS1的重组蛋白,分析该重组蛋白对底物的催化活性,并通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)对酶促反应产物进行鉴定.利用qRT-PCR技术对AgCHS1在藤茶不同器官的表达水平进行分析,并采用硝酸铝比色法测定相应的总黄酮含量变化.构建植物过量表达载体,通过叶盘法转化烟草,筛选阳性转基因后代,对T2代株系花瓣中的花青素和黄酮醇含量进行检测.[结果]AgCHS1的ORF长1182 bp,编码393个氨基酸,基因组序列长1315 bp,含2个外显子和1个内含子.生物信息学分析表明,AgCHS1为稳定的亲水蛋白.通过与其他物种的CHS蛋白多序列比对发现,AgCHS1含有查尔酮合成酶家族的特征序列和活性位点残基,包括丙二酰CoA结合位点和三联活性中心位点,与其他物种的CHS序列一致性较高.系统进化分析显示,AgCHS1与葡萄、山葡萄的CHS处于同一进化分支,亲缘关系最近.荧光定量PCR结果表明,AgCHS1在成熟叶和花中的表达量最高,在老叶中的表达量最低.藤茶不同器官的总黄酮含量与AgCHS1表达水平呈显著正相关.体外酶活性分析显示,重组的AgCHS1蛋白可以催化底物对-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素,说明该蛋白具有查尔酮合成酶活性.获得5株烟草转基因阳性株系,其中2株的花瓣颜色明显加深;与对照相比,转基因株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分别提高56.6％和25.3％,OE3的黄酮醇含量没有显著差异,OE4的黄酮醇含量提高39.1％.[结论]AgCHS1是藤茶中催化合成查尔酮的关键酶,过量表达AgCHS1可以提高转基因植物中花青素和黄酮醇的含量.

关键词：藤茶、查尔酮合成酶、酶活性、花青素、黄酮醇

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资助基金：国家科技支撑计划;福建农林大学科技创新专项基金

在线出版日期：2021-01-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：5091-5103