耐草甘膦转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系的建立及应用

摘要：

[目的]建立一种精准、高效的草甘膦抗性基因G2-EPSPS和GAT的检测方法,为转基因大豆新品系ZH10-6的广泛应用提供技术支持.[方法]根据抗草甘膦大豆ZH10-6和受体中黄10的分子特征,设计大豆内源参考基因(Actin)、外源基因(G2-EPSPS和GAT)以及侧翼序列(G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2)的特异性引物,通过PCR扩增测试引物的特异性和适用性.调整引物配比、DNA模板量、dNTP含量、退火温度和延伸温度等,筛选该多重PCR体系的最适扩增条件.将转基因大豆ZH10-6和受体中黄1 0的基因组DNA按质量比混合,制备成100％、50％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％和0的DNA样品,进行灵敏度检测.运用建立的多重PCR体系检测转基因大豆ZH10-6不同地理来源的11份衍生品系,并根据鉴定结果对该体系的应用性进行评价.[结果]建立的多重PCR方法中引物GmActin11 F/R、G2-EPSPS F/R、GAT F/R、ZH10P1/GAT和G2/ZH10P2可分别扩增出转基因大豆ZH10-6大小为126、4 30、338、81 0和1 626 bp的特异性目标条带.用该方法扩增受体中黄1 0时,除了GmActin11 F/R可以扩增出126 bp目标条带,侧翼序列上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2也可以扩增出632 bp目标条带.多重PCR最适扩增体系为DNA模板量100 ng、5U·μL-1 Ex Taq 0.2μL、10×ExTaq Buffer 2.5 μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2μL、10μmol·L-1引物(GmActinll F/R 0.4 μL、G2-EPSPS F/R 0.6μL、GAT F/R 0.4 μL、ZH10P1/GAT 0.6μL和G2/ZH10P2 0.6 μL),ddH2O补足25 μL.多重PCR扩增最适程序为95℃ 5 min;95℃ 30 s,60℃ 30 s,68℃ 1 min 20 s,35个循环;72℃ 12 min.该多重PCR体系灵敏度为0.5％,符合欧盟有关转基因产品标识的要求.该多重PCR方法特异性很强,可以成功检测受体中黄10、转基因大豆ZH10-6及ZH10-6不同地理来源的11个衍生品系.[结论]建立的转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系具有高通量、特异性强、操作简便和应用广泛的优点,并且能够快速、准确地检测转基因大豆ZH10-6及其衍生品系.

关键词：转基因大豆、抗除草剂、外源基因、侧翼序列、多重PCR

所属期刊栏目：53

资助基金：抗除草剂转基因大豆新品种培育2016ZX08004001

在线出版日期：2020-11-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共10页

页码：4127-4136