莲藕多酚氧化酶互作蛋白的筛选及验证

摘要：

[目的]以中国莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的多酚氧化酶家族成员之一NnPP01 (GenBank:ADC92563.1)为研究对象,筛选、验证与其互作的蛋白,为深入研究莲藕PP0的分子作用机制、精准抑制其活性奠定基础.[方法]利用酵母双杂交(Y2H)技术,验证莲藕抗氧化酶是否与NnPP01存在互作关系.通过转化酵母试验检测互作蛋白过氧化氢酶同工酶NnCAT1(GenBank: XP_010242894.1)的毒性和自激活活性.构建双分子荧光标记试验(BiFC)所用的35S-NnPP01-SPYNER173、35S-NnCAT1-SPYCEM表达载体,通过农杆菌介导法,将重组质粒转化烟草,进一步验证NnPP01与NnCAT1之间的互作关系.根据NnPP01和NnCAT1的结构域截短蛋白,寻找互作关键结构域.利用PlantCARE分析NnPP01与NnCAT1启动子相关作用元件,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析NnPP01与NnCAT1在莲藕不同组织中的表达水平.采用同源重组的方法构建35S-NnCAT1-GFP融合蛋白表达载体,用于亚细胞定位分析.运用DNAMAN软件对NnCAT1序列和其他物种序列进行多序列比对.运用生物信息学网站对NnCAT1进行理化性质与结构分析.[结果]NnCAT1与NnPP01存在蛋白互作,且NnCAT1蛋白无自激活作用,对酵母菌株也没有毒性.在细胞膜和细胞核上观察到黄色荧光信号,进一步证实NnPP01与NnCAT1之间存在互作.NnPP01的酪氨酸酶结构域在蛋白互作中发挥主要作用.NnPP01与NnCAT1启动子序列上存在多种顺式调控元件,如光响应元件Box 4、GT1-motif、TCT-motif,逆境响应元件ARE以及激素响应元件CGTCA-motif、TGACG-motif等.NnPP01与NnCAT1的表达模式基本相同,在各组织中均有表达,均在叶中表达量最高,在茎尖中表达量最低.亚细胞定位结果显示NnCAT1定位于细胞膜和细胞核中.莲藕NnCAT1的相对分子质量约为57.0 kD,理论等电点(PI)为6.93;该蛋白为同源四聚体亲水性蛋白质;无跨膜结构和信号肽,存在叶绿体转运肽,前21 aa为转运肽区域;二级结构由27.64％的α-螺旋、15.65％延长链、6.30％β-转角和50.41％无规则卷曲构成.[结论]筛选出NnCAT1与NnPP01之间存在蛋白互作,用BiFC进一步证实两者互作的真实性,NnPP01保守的酪氨酸酶结构域在互作中发挥主要作用;NnPP01与NnCAT1的表达模式基本相同,推测NnPP01与NnCAT1协同互作导致莲藕等果蔬褐变.

关键词：莲藕、NnPP01、NnCAT1、蛋白互作、亚细胞定位、组织特异性表达

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资助基金：国家重点研发计划;国家杨凌农业高新技术产业示范区科技计划

在线出版日期：2020-11-12（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共15页

页码：3777-3791