飞蝗核受体基因LmE75的分子特性和功能分析

摘要：

[目的]核受体(nuclear receptor,NR)是一类配体依赖型的转录因子,在昆虫生长发育过程中发挥重要作用,本文以重要农业害虫飞蝗(Locusta migratoria)为研究对象,分析核受体基因LmE75的分子特性以及功能,为害虫防治提供新分子靶标.[方法]基于飞蝗转录组数据库获得3条LmE75的cDNA序列,运用Blast和ExPASy网站中相关软件分析各个基因的开放阅读框、预测氨基酸序列、理化特性及保守结构域;使用MEGA 6.0软件中邻接法(neighbor-joining,NJ)与其他昆虫同源序列进行聚类分析.利用Primer 3.0软件设计3个LmE75亚型的特异性表达引物,运用reverse transcription-quantitative PCR(RT-qPCR)技术分析3个LmE75亚型在5龄若虫不同组织及4—5龄不同发育日龄的表达特性.体内注射蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)诱导和干扰20E受体基因LmEcR的表达后,RT-qPCR检测LmE75的表达,明确LmE75是否受20E调控.利用RNAi(RNA interference)技术,将体外合成的LmE75亚型共同区域的dsRNA注射至5龄飞蝗若虫体内,48 h后提取体壁RNA,反转录为cDNA,运用RT-qPCR技术检测LmE75亚型的沉默效率并观察表型;之后进一步利用H&E(hematoxylin and eosin)染色方法观察LmE75对飞蝗表皮结构的影响.[结果]基于飞蝗转录组数据库获得3条LmE75的cDNA序列,根据其结构特征命名为LmE75A、LmE75B和LmE75C,GenBank登录号分别为MN584732、MN584733和MN584734.3个LmE75亚型均具有典型的核受体结构域,其中DBD(DNA binding domain)和LBD(ligand binding domain)在各昆虫中高度保守;E75聚类分析结果显示不同目的昆虫类群E75亚型优先聚为一支;RT-qPCR结果显示3个LmE75亚型具有不同的组织和发育表达特性.LmE75A在体壁和肌肉中高表达;LmE75B在体壁中高表达,其次是前肠;LmE75C特异性在体壁高表达;LmE75A在4龄和5龄期均呈现先升高后降低的表达趋势;LmE75B在N4D3和N5D5表达量最高,蜕皮前后表达量均较低;LmE75C在4龄和5龄期均呈现逐渐升高的表达趋势,在蜕皮前表达量最高.20E诱导3 h和6 h后,处理组LmE75的表达量较对照组分别上调了4.2倍和4.5倍.利用RNAi技术干扰LmEcR 48 h后LmE75的表达量较对照组下调59％,表明LmE75受20E调控.在5龄第1天注射dsLmE75后的飞蝗具有明显的发育延迟现象,若虫无法蜕皮至成虫并最终100％死亡.体壁H&E染色结果显示,注射dsLmE75组飞蝗没有发生皮层溶离现象.[结论]飞蝗中有3个LmE75亚型,三者具有不同的组织和发育表达特性;RNAi试验表明,LmE75在飞蝗蜕皮过程中发挥重要作用.

关键词：飞蝗、核受体、LmE75、蜕皮激素、RNA干扰

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资助基金：国家自然科学基金;山西省高校科技创新项目;山西省面上青年基金项目

在线出版日期：2020-06-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）

页数：共13页

页码：2219-2231